[发明专利]一种CD3+TCRVα7.2+T细胞培养基和扩增培养方法

说明书

本发明提供了一种CD3+TCRVα7.2+T细胞培养基和细胞扩增培养方法。该培养基为基础培养基中含有3～10％的FBS、10～50U/mL的IL‑2、10～50ng/mL的IL‑15；所述基础培养基选自RPMI 1640培养基、T009培养基、AIMV培养基、DMEM培养基、X‑VIVO培养基中的一种或多种。本发明开辟出了一种新的T细胞亚型——CD3+TCRVα7.2+T细胞的获取和纯化的技术路线，其培养基经济成本较低，操作简单，能够在一定的时间段里面将细胞扩增倍数调整到与常规T细胞接近的程度，解决了CD3+TCRVα7.2+T细胞常见的扩增难度大的问题。

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种CD3+TCRVα7.2+T细胞培养基和扩增培养方法。

背景技术

目前关于CD3+TCRVα7.2+T细胞的研究较少，但MAIT细胞(其表型是CD3+TCRVα7.2+CD161+)的获取、培养方式主要有以下几种：

i.取自健康志愿者的新鲜的外周血(PBMC)，用抗体-Microbeads偶联的方式分选获得CD161+的细胞，立即对分出的细胞进行抗体染色，采用流式分选仪获得CD3+TCRVα7.2+CD161+的细胞，采用完全培养基(50％AIMV+50％RPMI1640+10％FBS+谷氨酰胺+β-巯基乙醇)培养，细胞密度范围在5E+05～2E+06个细胞/mL，培养箱环境是37℃，5％CO₂(卢湧湧，膀胱癌患者体内粘膜相关恒定T细胞(MAIT)的数量、功能及其抗肿瘤作用研究，2017学位论文，山东大学)。

ii.用抗CD3磁珠和Auto MACS分离CD3+T细胞，纯化后分别用抗CD4、抗CD161和抗TCRVα7.2的抗体染色，经过流式分选获得MAIT细胞(CD4﹣CD161+TCRVα7.2+T)细胞。分选后当天用CD3和CD28的抗体激活三天，洗去抗体后继续扩大培养，培养基为含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640，细胞密度约1E+06个细胞/mL，培养箱环境是37℃，5％CO₂(Duan,M.,etal.,Activated and Exhausted MAIT Cells Foster Disease Progression andIndicate Poor Outcome in Hepatocellular Carcinoma.Clin Cancer Res,2019.25(11):p.3304-3316)。

iii.收集健康志愿者的PBMC，采用流式分选仪获得MAIT细胞，原代人MAIT细胞在混合培养基中培养21天。培养基成分包括：50％AIMV、50％RPMI 1640、10％FBS、2％人AB血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM谷氨酰胺、0.1mM丙酮酸钠、15mM的HEPES buffer、PH＝7.2-7.5、50U/mL rhu IL-2、10ng/mL rhu IL-7、50ng/mL rhu IL-12、50ng/mL IL-15、50U/mL IL-18、50μM的2-巯基乙醇。在培养的第1、5、10天分别加入50nM的5-OP-RU，从第10天起去掉其中的IL-12、IL-18和IL-7(Gherardin,N.A.,et al.,Enumeration,functionalresponses and cytotoxic capacity of MAIT cells in newly diagnosed andrelapsed multiple myeloma.Sci Rep,2018.8(1):p.4159)。