[发明专利]诱导多能干细胞有饲养层的培养方法及应用

说明书

本发明提供了诱导多能干细胞有饲养层的培养方法及应用，培养方法包括：1)在培养瓶中加入明胶，摇匀覆盖底面，放于37℃培养箱至少15min，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液，将复苏的MEF饲养层细胞制成单细胞悬液并传代至P3代，加入到培养瓶中；2)将复苏的iPS细胞制成单细胞悬液，转移至铺好MEF饲养层细胞的培养板中，置于37℃，5％CO₂培养箱继续培养；3)将传代培养的iPS细胞用0.125％的胰酶消化细胞后，用不含MEF的小鼠胚胎干细胞培养液制成单细胞悬液，接种在0.1％明胶预先包被的培养皿中，37℃孵育50min去除MEF后，将上液移入培养板中培养，以制备EBS拟胚体。

技术领域

本发明属于诱导多能干细胞培养技术领域，涉及诱导多能干细胞有饲养层的培养方法及应用。

背景技术

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)最初是日本科学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)于2006年利用病毒载体将四个转录因子(Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞和胚胎APSC多能细胞的一种细胞类型。随后世界各地不同科学家陆续发现其它方法同样也可以制造这种细胞。

iPS细胞建立的过程主要包括：

(1)分离和培养宿主细胞；

(2)通过病毒介导或者其他的方式将若干多个多能性相关的基因导入宿主细胞；

(3)将病毒感染后的细胞种植于饲养层细胞上，并于ES细胞专用培养体系中培养，同时在培养中根据需要加入相应的小分子物质以促进重编程；

(4)出现ES样克隆后进行iPS细胞的鉴定(细胞形态、表观遗传学、体外分化潜能等方面)。

发明内容

本发明提供了诱导多能干细胞有饲养层的培养方法及应用，可应用于大鼠脑缺血模型及其细胞治疗研究。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了诱导多能干细胞有饲养层的培养方法，包括：

1)在培养瓶中加入明胶，摇匀覆盖底面，放于37℃培养箱至少15min，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液，将复苏的MEF饲养层细胞制成单细胞悬液并传代至P3代，加入到培养瓶中。

2)将复苏的iPS细胞制成单细胞悬液，转移至铺好MEF饲养层细胞的培养板中，置于37℃，5％CO₂培养箱继续培养。

3)将传代培养的iPS细胞用0.125％的胰酶消化细胞后，用不含MEF的小鼠胚胎干细胞培养液制成单细胞悬液，接种在0.1％明胶预先包被的培养皿中，37℃孵育50min去除MEF后，将上液移入培养板中培养，以制备EBS拟胚体。

优选地，步骤1)中，复苏MEF饲养层细胞并制成单细胞悬液的方法包括：将MEF饲养层细胞从冻存管中取出，37℃迅速溶解，用酒精擦洗冻存管外壁。将冻存管的细胞悬液转移至2mLMEF完全培养液的离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清，加入1mLMEF完全培养液，多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。

优选地，步骤1)中，P0代MEF细胞传至P3代且传至P3代的MEF细胞长至80％以上时，吸出旧的MEF完全培养液，加入含丝裂霉素C(终浓度10mg/ml)的新鲜MEF完全培养液。37℃培养箱温育处理3小时。吸出培养液，用PBS快速洗4遍以去除残余的丝裂霉素C。

更优选地，MEF饲养层细胞采用OSKM-1饲养层细胞。