[发明专利]诱导多能干细胞有饲养层的培养方法及应用

权利要求书

1.诱导多能干细胞有饲养层的培养方法，包括：

1)在培养瓶中加入明胶，摇匀覆盖底面，放于37℃培养箱至少15min，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液，将复苏的MEF饲养层细胞制成单细胞悬液并传代至P3代，加入到培养瓶中；

2)将复苏的iPS细胞制成单细胞悬液，转移至铺好MEF饲养层细胞的培养板中，置于37℃，5％CO₂培养箱继续培养；

3)将传代培养的iPS细胞用0.125％的胰酶消化细胞后，用不含MEF的小鼠胚胎干细胞培养液制成单细胞悬液，接种在0.1％明胶预先包被的培养皿中，37℃孵育50min去除MEF后，将上液移入培养板中培养，以制备EBS拟胚体。

2.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞有饲养层的培养方法，其特征在于，步骤1)中，复苏MEF饲养层细胞并制成单细胞悬液的方法包括：将MEF饲养层细胞从冻存管中取出，37℃迅速溶解，用酒精擦洗冻存管外壁；将冻存管的细胞悬液转移至2mLMEF完全培养液的离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清，加入1mLMEF完全培养液，多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。

3.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞有饲养层的培养方法，其特征在于，步骤1)中，P0代MEF细胞传至P3代且传至P3代的MEF细胞长至80％以上时，吸出旧的MEF完全培养液，加入含丝裂霉素C的新鲜MEF完全培养液，37℃培养箱温育处理3小时，吸出培养液，用PBS快速洗4遍以去除残余的丝裂霉素C。

4.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞有饲养层的培养方法，其特征在于，MEF饲养层细胞采用OSKM-1饲养层细胞。

5.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞有饲养层的培养方法，其特征在于，步骤2)中，复苏iPS细胞并制成单细胞悬液的方法包括：将IPSCs细胞冻存管迅速从液氮罐中取出，37℃迅速溶解，用酒精擦洗冻存管外壁，将冻存管的细胞悬液转移至5mL iPS细胞完全培养液的离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清，加入新鲜的iPS细胞完全培养液，多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。

6.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞有饲养层的培养方法，其特征在于，步骤3)中，iPS细胞传代培养的方法包括：吸除废液，用PBS轻轻冲洗一遍，加入1mL含EDTA的0.25％胰蛋白酶至培养瓶中，轻轻晃动，使胰蛋白酶覆盖底面，置于37℃消化细胞，消化2min，加入小鼠iPS细胞完全培养液终止消化，1000rpm离心5分钟，弃上清，加入1mL小鼠iPS细胞完全培养液，多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液，加入5mL的小鼠iPS细胞完全培养液吹打混匀，装入铺好MEF细胞的培养瓶中，5％CO₂培养箱中继续培养，并在培养瓶上标明传代的次数及日期，每天换液。

7.权利要求1-6任意一项所述的诱导多能干细胞有饲养层的培养方法在制备治疗大鼠脑缺血的实验动物模型中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将培养分离好的第三代iPS细胞稀释至1×10⁵/μL，注射到大鼠脑缺血模型的脑缺血部位。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，于术后3d在脑立体定位仪定位下于前囟左侧3.5mm、前0.5mm、深4.5mm处用微量进样器注入10μl细胞。