[发明专利]一种lacZ失活的基因工程菌及其在人乳寡糖生产中的应用

说明书

本发明公开了一种基因工程菌，其为整合了溶原性λDE3的大肠杆菌，且lacZ基因完全失活，但不影响所述基因工程菌的外源蛋白表达。还公开了所述基因工程菌的培养方法，及利用其制备人乳寡糖的制备方法和所述基因工程菌的应用。本发明的基因工程菌能有效地生产人乳寡糖，例如2'‑岩藻糖基乳糖，具有广泛的工业应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因失活的基因工程菌及其在人乳寡糖生产中的应用。

背景技术

人乳由碳水化合物、蛋白质、脂类、激素和微量元素的混合物组成，不仅能为婴儿的生长发育提供所需要的营养成分，还可以提供保护剂，如免疫球蛋白等。除此之外，人乳还包含一系列具有保护特性的复合低聚糖——人乳寡糖。

人乳寡糖(Human milk oligosaccharides，HMOs)是人乳中一类结构复杂的非消化性碳水化合物，在人初乳中的含量为22～24g/L，在正常人乳中的含量为5～12g/L，是人乳中含量仅次于脂肪和乳糖的第三大固体成分。HMOs通过刺激新生儿中有益肠道细菌如双歧杆菌和乳酸杆菌的生长，平衡肠道菌群的发育可能对调节新生儿出生后免疫系统起重要作用，作为先进婴儿配方食品的功能性成分非常重要。此外，HMOs可以抑制病原体与上皮细胞表面聚糖的粘附，从而限制一些病原体的毒力。

人乳中大概存在200多种不同的寡糖，目前已确定结构的人乳寡糖有115种。根据组成HMOs的单糖结构单元，HMOs可分为中性岩藻糖基乳糖，酸性唾液酸乳糖和中性非岩藻糖基化乳糖三种。

全细胞生物合成法为HMOs的一种制备方法，其中需要添加乳糖作为原料，而细胞中β-半乳糖苷酶会分解乳糖，从而降低了乳糖的利用，影响HMOs的产量，因此HMOs的生产多采用在宿主细胞中敲除或部分敲除lacZ(β-半乳糖苷酶基因)的方式，降低细胞内β-半乳糖苷酶的活性，从而提高HMOs的产量。目前生产上采用的主要是含有lacZ(ΔM15)缺陷型的克隆宿主，如top10，DH5α，JM109等。但是这些宿主类型，并不能完全消除lacZ的表达，同时因为缺少T7 RNA聚合酶基因，难于表达含有T7强启动子系列的载体，因此也限制了HMOs的产量。

在诸多关于2'-岩藻糖基乳糖(2'Fucosyllactose,2'-FL)生产的报道中如CN109790559A、Journal of Biotechnology 210(2015)107–115等都采用了lacZ(ΔM15)缺陷型宿主(不含λDE3)做底盘细胞，但此类细胞中β-半乳糖苷酶仍保留了3％的活性，这有可能是发酵生产中乳糖降解的隐患(Journal of Biotechnology 210(2015)107–115)。这是因为E.coli在缺乏乳糖的条件下细胞中β-半乳糖苷酶含量很低，大约每个细胞不高于5个分子，当加入乳糖后仅在2-3分钟之内每个细胞中β-半乳糖苷酶分子数就可以增长到5000个，酶分子数量的增加导致整体的酶活性增加，造成乳糖被分解的量增加，从而降低了生产效益。

由于lacZ(ΔM15)缺陷型的克隆宿主缺少T7 RNA聚合酶基因，后来衍生出了一些新的宿主类型，诸如DH5α(λDE3)，JM109(λDE3)等，这些宿主因为整合了溶原性λDE3，因此获得了T7 RNA聚合酶基因，可以被用于T7强启动子表达系统。然而Angela Zhang等(Metabolic Engineering 66(2021)12–2)的研究显示，在BL21 Star(λDE3)中，当完全缺失lacZ基因时，会导致外源蛋白表达功能丧失，测序后发现在attB整合位点，含有PlacUV5:lacZα-T7rnap的λDE3 lysogen发生了被切除。本发明人在JM109(λDE3)的基础上敲除或者部分敲除lacZ基因，也发现了这种现象。这说明在含有溶原性λDE3的宿主中敲除或部分敲除lacZ基因，外源蛋白表达功能丧失是一种普遍存在的现象。

因此，使用整合了溶原性λDE3的大肠细胞做为底盘时，在以乳糖为受体的HMOs生产过程中，实现lacZ基因的完全失活，同时保证外源蛋白稳定表达，是一个非常值得研究的经济和科学问题。