[发明专利]壳聚糖-聚二甲双胍在作为基因转染试剂方面的应用

说明书

本发明属于生物医药技术领域，本发明公开了壳聚糖‑聚二甲双胍（CS‑PolyMet）在作为基因转染试剂方面的应用。还公开了壳聚糖‑聚二甲双胍的制备方法，包括以下过程：称取0.5 g壳聚糖，加20 mL水，搅拌至充分溶胀，加入2 M盐酸1 mL，继续搅拌至壳聚糖完全溶解，放入100℃油浴中，搅拌条件下分批加入0.5 g双氰胺，回流反应24 h，反应完毕后纯水透析3天，冷冻干燥，得白色絮状的CS‑PolyMet粉末，易溶于水，粉末可4℃保存。本发明合成的壳聚糖‑聚二甲双胍可通过聚合物本身正电荷与细胞周期同步效应高效转染目的基因，转染效果优于现有市售试剂，并且细胞毒性较市售试剂更低，具有潜在的市场应用价值。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及壳聚糖-聚二甲双胍(CS-PolyMet)在作为基因转染试剂方面的应用及壳聚糖-聚二甲双胍(CS-PolyMet)的制备方法。

背景技术

基因药物易于降解，不易穿透细胞膜等各类屏障系统进入细胞，需借助有效的递送载体才能发挥作用。因此，开发高效的基因递送载体是当前亟待解决的研究问题。基因转染是生命科学、医药、农业领域的常用操作技术。现有的基因转染技术普遍存在转染效率低以及毒性等问题。

目前，常用的基因递送载体包括病毒载体与非病毒载体二类。病毒载体(腺相关病毒和慢病毒)可有效递送基因，但有许多局限性，如具有潜在的致癌作用、免疫原性、有限的DNA包装尺寸，生产难度大。非病毒载体表现出相对较少的副作用，在基因递送方面具有独特优势。阳离子聚合物是一类应用最为广泛的非病毒载体，在生理pH范围内具有较高的DNA包装能力。阳离子聚合物通过修饰、静电吸附等作用与核酸形成纳米复合物，提高核酸稳定性与细胞摄取效率，实现基因转染。常用的阳离子聚合物有聚乙烯亚胺(PEI)赖氨酸，聚己内酯等，存在毒性较高、合成成本高等缺点。

壳聚糖(Chitosan)是天然高分子碱性多糖，来源广泛，生物相容，无毒，无免疫原性，生物可降解，经酰基化、羧基化、羟基化、季铵化、醇化、酯化等改性修饰制备成的功能化衍生物常常具有较好的理化性质与生物学性能，能够满足生物化工领域的多种需求。二甲双胍是一种安全性高、成本低的双胍类药物，临床用于治疗2型糖尿病。目前，发现二甲双胍还是一种低毒的抗肿瘤药物，通过PP2A-GSK3β-MCL-1通路促进肿瘤细胞凋亡，对乳腺癌、肺癌等多种癌症有效。也有报道指出二甲双胍的抗癌作用主要归因于其对AMPK激酶的激活作用和对mTOR的抑制作用。本发明基于壳聚糖与二甲双胍，提出一种基因转染试剂，解决现有基因转染试剂毒性高、合成成本高、转染效率有限的问题。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的问题或不足，本发明提供一种壳聚糖-聚二甲双胍(CS-PolyMet)在作为基因转染试剂方面的应用及壳聚糖-聚二甲双胍(CS-PolyMet)的制备方法。

为实现上述发明目的，本发明的实施例提供壳聚糖-聚二甲双胍(CS-PolyMet)在作为基因转染试剂方面的应用，并与市售试剂进行转染效果比较。

进一步的，壳聚糖-聚二甲双胍可使细胞周期同步至G2/M期，实现高效的细胞转染。

进一步的，具体包括以下过程：

S1、试剂的预混：CS-PolyMet溶液和pDNA溶液等体积混合；CS-PolyMet与DNA/RNA的质量比为10:1，涡旋3s，37℃温育30min；制备得到待转染的复合物CS-PolyMet/pDNA；

S2、转染DNA/RNA至细胞：贴壁细胞以一定密度接种至6孔板，培养24h，换用无血清培养基，每孔分别加入CS-PolyMet/pDNA(含2μg pDNA)，培养24h。

本发明的实施例还提供一种基因转染试剂，其特征在于，采用壳聚糖-聚二甲双胍。

进一步的，所述基因转染试剂通过聚合物所携带的正电荷负载基因并穿膜，通过二甲双胍的活性作用使细胞周期同步至G2/M期，一步实现高效的基因转染。