[发明专利]一种芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白及其制备方法和应用，涉及生物基因技术领域；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.5所示。本本发明的融合蛋白经过证实，在不影响芋螺毒素功效的前提下，胶原蛋白融合能够有效的降低芋螺毒素细胞毒性，提高原料生物安全性；同时在分子设计时添加了透皮肽，其除皱和保湿能力经过功效验证，证明了透皮肽的加入可以有效的增加融合蛋白透皮吸收能力，促进了芋螺毒素的透皮吸收。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholinereceplors.nAChRs)是人们最早发现的一类受体。是介导突触间快速信号传递的配体门控离子通道蛋白、在中枢和外周神经系统及肌肉中广泛分布。nAChR分为肌肉型和神经型两种，是由5个亚基组成的跨膜五聚体，其中肌肉型nAChR普遍存在于脊椎动物骨骼肌细胞以及某些鱼的放电器官细胞的质膜上。受体与乙酰胆碱结合，引起Na⁺通道的开放，Na⁺流入靶细胞，使得质膜去极化并引起细胞的收缩。它分为神经型和肌肉型两大类。肌肉型nAChRs由5个亚基(2α、18、18和1y/ε)组成。

芋螺毒素(Conotoxin，CTX)是海洋软体动物芋螺的毒管组织分泌的由10～50个氨基酸残基组成的小肽。芋螺毒素通过选择性靶向不同类型的神经递质受体或电压门控离子通道，通常被用作神经科学研究和药物开发的分子工具。根据芋螺毒素高度保守的信号肽序列，将芋螺毒素分为A、M、O、P、S、T、I、V、Y、J等14个超家族，根据其药理学作用靶点，又分为α、μ、の、K、8、V、σ、p、γ、加压素、惊厥剂和睡眠肽等亚家族。其中A-超家族芋螺毒素又可根据药理学作用靶点进一步分为α-、κA-、αA-家族。α-家族芋螺毒素具有典型的CC-C-C半胱氨酸框架，通常由12～19个氨基酸残基组成，主要作用靶点为烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)。α-芋螺毒素能与神经肌肉接头处突触后膜上nAChR的α亚基结合，从而竞争性地抑制乙酰胆碱与受体结合，阻断神经-肌肉兴奋信号的传递。有研究表明来源于α-芋螺毒素的多肽对于肌肉收缩的抑制作用，其中芋螺毒素Reg1对肌细胞和骨骼肌的收缩表现出了明显的抑制作用，同时也具有良好的安全性。它与来源于蛇毒的三肽化合物SYN-AKE蛋白质片段的化学物质，表现出了相似的生物活性。而SYN-AKE被广泛地应用到了抗皱类的化妆品中，说明α-家族芋螺毒素有望开发成为一种新的原料，应用于抗皱纹类化妆品中。

胶原蛋白作为一种纤维蛋白，其基本组成单位是原胶原分子。原胶原分子是由三股α-螺旋结构的肽链缠绕形成的纤维状蛋白，长度约为300nm，直径约1.5nm，分子量为300kDa。胶原中含有大量的甘氨酸，约占总氨基酸残基的1/3，其一级结构(肽链)均为(Gly-X-Y)_n重复序列；其次是脯氨酸和羟脯氨酸，含量高达15％至30％，这两种氨基酸为胶原所特有，但色氨酸、酪氨酸及蛋氨酸等必需氨基酸含量低。

胶原蛋白能够保护皮肤，提高皮肤的弹性。胶原蛋白占皮肤成分的70％，皮肤有如一个大套子紧紧包住身体各处，表面积相当大，人体四肢活动时，皮肤中胶原蛋白发挥功能，使皮肤具有保护功能，又能适当增加弹性及坚硬度，使肌肉细胞互相连接，并使其富有弹性和光泽。由于胶原及其水解物与人皮肤胶原的结构相似，相容性好，可以扩散到皮肤的深层，对人的皮肤有很好的营养作用，且胶原蛋白分子外侧存在大量的羧基和羟基，同时存在大量的甘氨酸等天然保湿因子，能提高组织细胞的贮水能力，使皮肤保湿；许多种胶原蛋白多肽与皮肤细胞的生长、分化、分裂、增殖和迁移有关，能提供皮肤的养分，延缓皮肤衰老，促进皮肤创面修复；胶原蛋白溶液还有很强的抗辐射作用，因而广泛应用于化妆品行业。

但目前市售的芋螺毒素细胞毒性较高，导致其原料生物安全性较低，且芋螺毒素的除皱和保湿能力普遍较弱。

发明内容

为克服现有的技术缺陷，本发明目的在于提供一种芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白及其制备方法和应用。