[发明专利]一种芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.5所示。

2.根据权利要求1所述的芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由如下氨基酸肽段融合组成:

芋螺毒素肽段，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；

类人源胶原蛋白肽段，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；

连接肽肽段，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；

透皮肽肽段，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

3.一种如权利要求1或2所述的芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)基因的获得

人工设计并合成融合蛋白对应的核苷酸序列，如SEQ.ID.NO.6所示，在序列的两端直接加入酶切位点；

2)pPIC9k-CTX-HCY重组质粒的构建

利用XhoI和Not I限制性内切酶对人工合成的序列及毕赤酵母通用载体进行双酶切，酶切后回收对应的目的基因及载体，利用T4 DNA连接酶连接转化大肠杆菌，测序鉴定获得正确的pPIC9k-CTX-HCY重组质粒；

3)pPIC9k-CTX-HCY重组质粒转化GS115酵母感受态

pPIC9k-CTX-HCY重组质粒利用Sal I线性化后，对其进行纯化回收，然后对回收的200μL质粒置45℃烘箱中烘烤干燥浓缩质粒至10-20μL；之后利用电转化仪将pPIC9k-CTX-HCY重组质粒转化至毕赤酵母GS115，G418筛选高拷贝转化子；

4)重组酵母转化子的鉴定

采用冻融法提取转化子基因组DNA，PCR鉴定；

5)GS115/pPIC9k-CTX-HCY酵母转化子在摇瓶中的表达

利用BMGY和BMMY培养基对PCR鉴定正确的转化子进行摇瓶发酵表达，甲醇诱导发酵，SDS-PAGE电泳检测表达结果；

6)融合蛋白的纯化

利用CM-琼脂糖凝胶FF离子交换层析柱对融合蛋白的发酵液进行纯化，挂柱洗脱，收集洗脱液，最后将洗脱液透析脱盐冻干，获得融合蛋白。

4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1或2所述的芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白的核苷酸序列或其互补序列。

5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。

6.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求4或5所述的核酸分子。

7.根据权利要求1或2所述的芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白、权利要求4或5所述的核酸分子、权利要求6所述的载体在化妆品或医美产品中的应用。