[发明专利]一种CHO细胞基因NW_003613781.1内稳定表达蛋白质的位点及其应用

说明书

本发明公开了一种CHO细胞基因NW_003613781.1内稳定表达蛋白质的位点及其应用，本发明获得的稳定表达位点位于CHO细胞基因NW_003613781.1的第1497187碱基处上下游100bp范围内碱基，即第1497087‑1497287碱基处，可整合外源蛋白质基因并进行稳定表达。本发明通过定点整合的方式将目的基因定点整合到上述稳定表达区域，解决了随机整合所带来的整合位点不明确的问题；本发明通过CHO基因组内稳定表达位点NW_003613781.1的第1497187碱基处上下游1497087‑1497287碱基范围内定点整合外源基因克服了位置效应所带来的表达不稳定性以及反复繁琐的细胞株筛选过程。

技术领域

本发明涉及一种CHO细胞基因NW_003613781.1内稳定表达蛋白质的位点及其应用，属于基因技术领域。

背景技术

中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是1957年在Dr.TheodoreT.Puck的实验室中建立的，是一种永生化的非分泌型细胞，很少分泌内源蛋白；同时因其具有与人类天然蛋白更接近的翻译后修饰、不易受人类病毒感染、能在化学成分明确的无血清培养基中大规模培养等优点，被广泛应用于生物制药领域，生产了超过70％的蛋白类药物。然而CHO细胞作为哺乳动物细胞，培养周期长，培养成本高，而同时单克隆抗体等重组产品的需求不断增加，持续增长的需求意味着比生产率仍需要优化。虽然通过增加基因的拷贝数、发展新的强启动子、寻找合适的增强子等方式可以提高表达量，但多数CHO细胞在长期培养过程中的表达水平不稳定，直接影响到监管部门对产品的审批与上市问题。因此构建稳定且高表达目的基因的CHO表达株对于蛋白类药物的研发与上市非常重要。

目前有两种构建稳定且高表达细胞株的策略。一种是传统的随机整合与高通量筛选相结合的方法，另一种是利用基因编辑技术与同源定向修复相结合的方法将目的基因定点整合到预定的染色体位点。但是，随机整合由于整合位点的不确定性，以及位置效应的存在，构建的细胞基因型差异巨大，且在长期传代的过程中容易发生表达不稳定的问题，导致后期的筛选过程非常漫长，在工业环境中，通过随机整合方式产生重组细胞系的整个过程通常需要6-12个月；与随机整合相比，定点整合利用基因编辑技术，尤其是近年来应用广泛的CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术，大大减少了研发时间和成本，且由于序列已知，定点整合后的信息比随机整合后的信息更加清晰明确。

随机整合是构建蛋白表达系统的最为成熟的传统方法，但通过随机整合方式获得稳定高表达细胞株需要经过多重筛选，耗时长，成本高。同时，对于随机整合获得的细胞系，在培养后期，对于细胞丧失表达稳定性完全无法预测：这种不稳定性可能完全不会发生；也可能在细胞出现了无数次的分裂之后，逐步显现；也可能在细胞仅仅分裂几代后，就出现了明显的不稳定性。而稳定性问题不仅仅只是会影响到产品上市时间，更会与药品法规管理产生一定冲突。另外随机整合位点的信息不明确，外源基因整合的位点效应也会导致目的基因的表达水平显著下降。根据已有的文献报道，这种重组CHO细胞系的不稳定性出现在了所有的重组CHO细胞系中，使不稳定表达的问题成为了一个极其普遍的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种CHO细胞基因组内稳定表达蛋白质的位点，该位点信息明确，在该位点能够实现蛋白基因的定点整合，且能稳定表达蛋白质，并能大量缩短细胞构建过程中的筛选流程与时间，降低研发成本。

本发明的第一个目的是提供一种CHO细胞基因组内稳定表达蛋白质的位点，所述的稳定表达蛋白质的位点位于CHO细胞基因NW_003613781.1的第1497087-1497287碱基内。

进一步地，所述的CHO细胞基因NW_003613781.1的第1497087-1497287碱基的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，在采用CRISPR/Cas9技术定点转入目的蛋白质的编码基因时，所述的稳定表达蛋白质的位点可被CRISPR/Cas9技术的5'NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG 3'序列识别。