[发明专利]一种高产3-岩藻糖基乳糖微生物的构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种高产3‑岩藻糖基乳糖微生物的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。本发明通过筛选高效的α‑1,3‑岩藻糖基转移酶基因，并通过组合调控3‑岩藻糖基乳糖合成途径中manC、manB、wcaG和gmd在大肠杆菌中的表达，使大肠杆菌拥有生产3‑岩藻糖基乳糖的合成能力，并能够精确调控代谢通路的碳通量，缓解代谢压力。在摇瓶实验中，大肠杆菌生产3‑岩藻糖基乳糖的能力为2.01g/L，在3L发酵罐中，3‑岩藻糖基乳糖的产量达到20.3g/L，具备良好工业应用的前景。

技术领域

本发明涉及一种高产3-岩藻糖基乳糖微生物的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。

背景技术

母乳寡糖对婴幼儿的智力发育、肠道健康、促进免疫力等方面起着重要的作用，其中被岩藻糖基化修饰的中性母乳寡糖占比最高，主要包括2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)和3-岩藻糖基乳糖(3-FL)。大量文献集中报道这两种岩藻糖基乳糖对婴幼儿的健康具有明显的促进作用，因此受到广泛关注，具备应用于婴幼儿产品的广泛前景。3-FL的合成研究对HMO的商业化应用至关重要，尤其是寻找到高效率、低成本、绿色环保的合成路线。近年来，3-FL的生物制备研究发展迅速，并体现出优于化学合成路线的诸多特性。因此3-FL的高效生产的方法急需开发，为生成更多有价值的母乳寡糖的合成奠定重要基础。

目前针对3-FL合成的研究主要为化学合成，酶法和微生物合成方法均较少。化学法合成通常需要引入保护基团，步骤繁冗，且存在保护不到位，后续脱除不彻底及发生其他副反应的问题，而且常需要使用有毒有害试剂。相比之下，生物法合成由于酶与底物的特异性高，底物廉价，合成步骤简化，副产物少，产率大大提高，更适合大规模的工业化生产。目前主要是采用微生物发酵法来合成3-岩藻糖基乳糖。微生物发酵法合成3-岩藻糖基乳糖需要一个关键的能催化前体乳糖和GDP-L-岩藻糖转化的α-1,3-岩藻糖基转移酶。目前α-1,3-岩藻糖基转移酶大多来自幽门螺旋杆菌，来源较为单一，且可溶性表达较弱。目前使用的微生物方法合成的3-岩藻糖基乳糖产量均较低，目前已报道的α-1,3-岩藻糖基转移酶的来源可能是一个限制因素，都不能达到工业化大规模生产的要求，因此，为了解决目前微生物生产的瓶颈，筛选出其他来源的α-1,3-岩藻糖基转移酶是解决3-岩藻糖基乳糖产量问题的一个重要步骤。

发明内容

针对现有的技术难点及存在的问题，发明人筛选到了一种来源于Bacteroidesgallinaceum的α-1,3-岩藻糖基转移酶，此酶在其他报道里只是提到这是个糖基转移酶，而还未发现其是3-岩藻糖基转移酶，本申请通过研究之后发现此酶以乳糖和GDP-L-岩藻糖为底物，生产3-岩藻糖基乳糖，可显著提升3-岩藻糖基乳糖的产量。

本发明提供了一种重组大肠杆菌，所述大肠杆菌表达了来源于Bacteroidesgallinaceum的α-1,3-岩藻糖基转移酶，表达磷酸甘露糖变位酶的基因，表达甘露糖-6-磷酸异构酶的基因，表达GDP-L-岩藻糖合成酶的基因，表达GDP-D-甘露糖脱氢酶；并且敲除编码β-半乳糖苷酶的基因、编码UDP-葡萄糖脂质载体转移酶的基因。

在一种实施方式中，编码所述磷酸甘露糖变位酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

在一种实施方式中，编码所述甘露糖-6-磷酸异构酶的基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

在一种实施方式中，编码所述GDP-L-岩藻糖合成酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

在一种实施方式中，编码所述GDP-D-甘露糖脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

在一种实施方式中，利用pCDFDuet-1、pRSFDuet-1，或pETDuet-1载体表达编码α-1,3-岩藻糖基转移酶的基因；利用pCDFDuet-1、pRSFDuet-1，或pETDuet-1载体共同表达编码磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-6-磷酸异构酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、GDP-D-甘露糖脱氢酶的基因。