[发明专利]氯羟吡啶人工抗原合成法及其在胶体金试剂盒中的应用

说明书

本发明公开了氯羟吡啶人工抗原合成法及其胶体金试剂盒检测方法，具体涉及生物技术领域。所述人工抗原合成法包括氯羟吡啶钠盐的制备、含有羧基的半抗原的制备和人工抗原的制备。所述检测方法包括利用氯羟吡啶胶体金检测试剂盒检测氯羟吡啶。所述检测方法包括样品采集；用微量移液器吸取待测样本溶解于微孔中，缓慢吸抽且充分与微孔中试剂混匀；一定温度下孵育一段时间后，将标记好的试纸条插入微孔中，使之充分浸入溶液中；再次孵育，取出试纸条并根据示意图判定结果即可。本发明氯羟吡啶半抗原合成方法收率较高，很大程度上降低了人工纯化的成本，对于完全抗原的制备也轻易很多。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及氯羟吡啶人工抗原合成法及其在胶体金试剂盒中的应用。

背景技术

氯羟吡啶（Clopidol，中文名：3,5-二氯-2,6-二甲基-4-羟基吡啶，氯吡醇，氯吡多，二氯二甲吡啶酚，克球粉等），是吡啶类化合物，具有广泛抗球虫作用，可用于禽，兔球虫病。氯羟吡啶分子式为C₇H₇Cl₂NO，CAS为2971-90-6，纯品为白色或类白色粉末，无臭。氯羟吡啶对9种艾美耳球虫的防治均有良好效果，特别对柔嫩艾美耳球虫的治疗作用最强。本品对球虫的活性高峰期是子孢子期（即感染后第一天），因此，必须在感染前或感染时用药，才能发挥抗球虫的作用。有资料表明，氯羟吡啶对机体的球虫免疫力有明显抑制作用，不要过早停药，否则往往会导致球虫病爆发。

氯羟吡啶已出现明显的耐药现象，由于本品结构与喹诺啉抗球虫药类似，有可能存在交叉耐药性。因此，养鸡场一旦发生耐药性，除停止应用外，不能换用喹诺林类抗虫药，如丁氧喹酯（Buquinolate），癸氧喹酯（Decoquinate）和苄氧喹甲酯（Nequinate）等。GB31650-2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》规定了牛、羊的肌肉、肝、肾和奶的最大残留限量分别为200μg/kg，1500μg/kg，3000μg/kg，20μg/kg，猪的可食组织的最大残留限量为200μg/kg，鸡、火鸡的肌肉、肝和肾的最大残留限量分别为5000μg/kg，15000μg/kg，15000μg/kg。

氯羟吡啶检测多采用液相色谱与质谱联用法（LCMS），核磁质谱（HNMS）等。仪器法分析具有较低的检测限，而且仪器检测操作复杂，费用昂贵，无法达到现场规模快速检测的要求。

现有合成方法合成率低，副产物多。

发明内容

为此，本发明提供氯羟吡啶人工抗原合成法及其在胶体金试剂盒中的应用，以解决现有氯羟吡啶人工抗原合成方法合成率低，副产物多，及氯羟吡啶仪器检测操作复杂，费用昂贵等问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

根据本发明的一方面提供一种氯羟吡啶人工抗原合成法，所述人工抗原合成法包括以下步骤：

步骤一，氯羟吡啶钠盐的制备

取氯羟吡啶，加入NaOH水溶液中，振荡超声至完全溶解，室温下反应0.5-1.5h后，停掉反应，减压蒸馏除去水分，常温下水洗生成物、抽虑、干燥，得氯羟吡啶钠盐；

步骤二，含有羧基的半抗原的制备

取氯羟吡啶钠盐，用三氯甲烷完全溶解，加入四丁基溴化铵，搅拌得A液；称取氯乙酸溶解在超纯水中，加入到A液中，50-80℃反应过夜，经过抽滤，干燥，萃取得到含有羧基的半抗原；

步骤三，人工抗原的制备

称取纯化的氯羟吡啶半抗原，溶解在DMF中，搅拌，得氯羟吡啶半抗原溶液；称取NHS，EDC，溶解到水中，加入到氯羟吡啶半抗原溶液中活化过夜，得活化氯羟吡啶半抗原溶液；