[发明专利]骆驼凝乳酶原突变蛋白及其编码基因和应用

说明书

本发明公开了骆驼凝乳酶原突变蛋白及其编码基因和应用。所述骆驼凝乳酶原突变蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1‑4所示，其编码基因的核苷酸序列分别为SEQ ID No.5‑8所示。本发明在骆驼凝乳酶原的自切割前导肽区域设计并分别突变四个氨基酸位点产生四个N‑糖基化保守序列，分别将其进行分泌表达时，突变点的区域分别形成一个N‑糖基化保守位点，使重组骆驼凝乳酶原的分泌表达水平显著提高，同时这些位点突变并不影响前导肽的自切割活性，且突变位点不在成熟蛋白上，因此不影响凝乳酶的凝乳活性。本发明骆驼凝乳酶原突变蛋白编码基因在毕赤酵母菌株中的表达量显著提升，在无需改变发酵生产工艺的条件下有效降低生产成本。

技术领域

本发明涉及凝乳酶突变蛋白及其应用，尤其涉及骆驼凝乳酶原突变蛋白及其编码基因，本发明进一步涉及骆驼凝乳酶原突变蛋白编码基因在制备重组骆驼凝乳酶中的应用，属于骆驼凝乳酶原突变蛋白及其应用领域。

背景技术

凝乳酶（EC3.4.23.4）属于天冬氨酸蛋白酶家族，主要来源于未断奶哺乳动物的胃黏膜细胞，能够特异性的切割K-酪蛋白中Phe₁₀₅和Met₁₀₆之间的肽键，破坏酪蛋白在水溶液中的稳定性，从而使乳液中的酪蛋白凝结而析出。凝乳酶是奶酪生产中的关键酶制剂，除了动物来源的凝乳酶外，还有植物和微生物来源的凝乳酶，但由于植物和微生物凝乳酶对酪蛋白具有明显的非特异性水解作用，生成较多的短肽使凝乳效率下降并产生苦味，因此，动物来源的凝乳酶被认为是奶酪生产中品质最好的凝乳酶种类。

随着世界范围内凝乳酶消耗量的增加，通过宰杀幼年哺乳动物提取凝乳酶的传统方法已不能满足需求，因此，利用转基因的方法获得重组动物凝乳酶成为工业凝乳酶的重要来源。微生物表达的牛凝乳酶是商业化应用最为广泛的重组动物凝乳酶，其它重组表达的凝乳酶还包括水牛、山羊、羔羊和骆驼等来源的，这些凝乳酶的氨基酸序列具有一定的同源性，分子量在35kDa到45kDa之间，但他们的作用底物具有一定的特异性，例如牛凝乳酶不能作用于骆驼奶，但骆驼凝乳酶既可以作用于骆驼奶，也可以作用于牛奶。在哺乳动物体内，凝乳酶都以凝乳酶原的形式分泌到胃中，在胃液的酸性环境下，凝乳酶原通过自我剪切去掉N端的前导肽而自我激活，产生凝乳活性。研究表明，牛凝乳酶原在pH2.0条件下，能够自我剪切掉N-端42个氨基酸，生成成熟的凝乳酶。在重组表达的情况下，前导肽对于活性是必须的，重组表达的成熟凝乳酶没有活性。重组的凝乳酶原需经过体外酸性-中和处理后才能够完成自我剪切过程并转变成具凝乳活性的成熟凝乳酶。