[发明专利]一种灵敏检测大肠杆菌O157:H7的酶联免疫方法

权利要求书

1.负载酶的聚电解质纳米胶囊在制备大肠杆菌O157:H7检测试剂盒中的应用，是以链霉亲和素修饰的负载酶的聚电解质纳米胶囊检测大肠杆菌O157:H7；

所述的负载酶的聚电解质纳米胶囊，是通过以下方法制备得到：

（1）通过共沉淀法将酶封装在可溶解的碳酸钙纳米颗粒中：将氯化钙溶液和聚苯乙烯磺酸钠溶液混合，搅拌下进行反应，然后加入碳酸钠溶液和酶溶液，搅拌下继续反应，反应结束后，离心，将沉淀用超纯水重悬，加入聚丙烯胺盐酸盐溶液，超声，震荡反应，离心，将沉淀用超纯水洗涤，得到沉淀；

（2）将步骤（1）得到的沉淀复溶于乙二胺四乙酸二钠溶液，溶解去除碳酸钙核，离心，将沉淀复溶于PBS溶液中制得负载酶的聚电解质胶囊；

步骤（1）中，所述的氯化钙溶液、聚苯乙烯磺酸钠溶液、碳酸钠溶液、酶溶液和聚丙烯胺盐酸盐溶液的体积比为1:0.5:1:1:0.2；所述的氯化钙溶液浓度为4.44 mg/mL，聚苯乙烯磺酸钠溶液浓度为50 mg/mL，碳酸钠溶液浓度为4.24 mg/mL，酶溶液浓度为2 mg/mL，聚丙烯胺盐酸盐溶液浓度为30 mg/mL；

步骤（2）中，所述的乙二胺四乙酸二钠溶液浓度为0.2 mol/L；

步骤（1）和（2）的离心条件为15000 rpm离心10 min；

所述的酶为辣根过氧化物酶。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的链霉亲和素修饰的负载酶的聚电解质纳米胶囊是通过以下方法制备得到：将链霉亲和素滴加到负载酶的聚电解质纳米胶囊溶液，室温下反应，然后加入BSA溶液，继续反应，离心，将沉淀溶于PBS溶液，即得。

3.一种检测大肠杆菌O157:H7的试剂盒，其特征在于，含有链霉亲和素修饰的负载酶的聚电解质纳米胶囊，所述的负载酶的聚电解质纳米胶囊的制备步骤如权利要求1所示。

4.一种灵敏检测大肠杆菌O157:H7的酶联免疫方法，是使用双抗夹心酶联免疫吸附法进行检测，其特征在于，与生物素化的大肠杆菌O157:H7抗体结合的是链霉亲和素修饰的负载酶的聚电解质纳米胶囊，所述的负载酶的聚电解质纳米胶囊的制备步骤如权利要求1所示。

5.根据权利要求4所述的灵敏检测大肠杆菌O157:H7的酶联免疫方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）在酶标板上包被大肠杆菌O157:H7捕获抗体，反应结束后，用缓冲液洗去多余液体；

（2）加入封闭液反应后，用缓冲液洗去多余液体；

（3）将待测溶液加至步骤2）包被有抗体的酶标板上，反应结束后，用缓冲液洗去多余液体；

（4）加入生物素修饰的大肠杆菌O157:H7抗体，反应结束后，用缓冲液洗去多余液体；

（5）将链霉亲和素修饰的负载酶的聚电解质纳米胶囊加入至步骤4）包被有抗体-抗原-抗体复合物的酶标板中，反应结束后，用缓冲液洗去多余液体；

（6）加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺反应后，用酶标仪测定吸光度值。

6. 根据权利要求5所述的灵敏检测大肠杆菌O157:H7的酶联免疫方法，其特征在于，步骤（1）中， 包被抗体用量为100 μL，浓度为5 μg/mL，反应条件为4℃反应过夜，其中包被抗体溶于pH 7.4，0.01 M的 PBS缓冲液中；

步骤（2）中，封闭液为10 mg/mL的BSA，用量为300 μL，反应条件为37℃下反应2小时；

步骤（3）中，大肠杆菌O157:H7菌液用量为100 μL，反应条件为37℃下反应1小时；

步骤（4）中，生物素化的大肠杆菌O157:H7抗体用量为100 μL，浓度为10 μg/mL，反应条件为37℃下反应1小时；

步骤（5）中，链霉亲和素修饰的聚电解质纳米胶囊用量为100 μL，浓度为15 μg/mL，反应条件为37℃下反应0.5小时；

步骤（6）中，3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色液用量为100 μL，反应条件为37℃下反应0.5小时，酶标仪检测波长为650 nm；

所述步骤（1）、（2）、（3）、（4）、（5）中的清洗缓冲液是PBST，具体配方为pH 7.4 ，0.01 MPBS缓冲液加入0.5‰的吐温20。