[发明专利]基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因的载体及构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因的载体及构建方法和应用，所述本氏烟基因为NbbZIP60基因，如SEQ ID NO:4所示；针对本氏烟NbbZIP60基因编码区序列靠近5’端的PAM位点设计特异性靶向NbbZIP60的gRNA，构建pCambia 1300‑BKG‑g1载体。将本发明的载体通过遗传转化的方法导入到本氏烟，获得的编辑后代生长状态正常，与野生型本氏烟相比没有明显的发育缺陷，获得基因敲除的植物能够有效抑制双生病毒的侵染。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因的载体和应用。

背景技术

TYLCCNV是一种单组份双生病毒，在田间伴随着卫星DNAβ(TYLCCNB)。 TYLCCNV/TYLCCNB复合侵染烟草、番茄、辣椒等多种茄科作物，感染的作物产生明显的矮化、叶片卷曲、黄化等症状，严重导致作物减产，造成巨大的经济损失，危害农业生产。

我国大部分省市的番茄、烟草等种植区长期受到TYLCCNV/TYLCCNB复合侵染的危害。目前，在研究和生产中可用的抗双生病毒资源非常有限，而且病毒的快速进化与田间、温室作物上病毒病的复合侵染严重等都会导致抗双生病毒的种质资源不断丧失抗性。如番茄Ty-1 介导的对番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的抗性会被其他病毒所抑制，抗木薯花叶病害(由多种木薯花叶双生病毒引起)的木薯CMD2抗性基因在植物体细胞胚胎发生再生时会丢失。

此外，目前生产上缺乏有效的抗病毒药剂来防治双生病毒病害，因此在以预防病毒病害发生的基础上，选育抗病毒品种尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因的载体及构建方法和应用。通过设计针对TYLCCNV/TYLCCNB研究的模式植物本氏烟的感病基因NbbZIP60的gRNA，构建了利用编辑上述内源基因实现阻碍双生病毒侵染的农杆菌侵染性克隆载体。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

一种基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因的载体的构建方法，其特征在于：所述本氏烟基因为NbbZIP60基因，如SEQ ID NO:4所示；针对本氏烟NbbZIP60基因编码区序列靠近 5’端的PAM位点设计特异性靶向NbbZIP60的gRNA，构建pCambia 1300-BKG-g1载体，简称BKG-g1载体。

具体而言，包括以下步骤：

(1)在本氏烟NbbZIP60基因编码区序列靠近5’端搜寻PAM位点并设计特异性靶向NbbZIP60的gRNA；

(2)根据所设计的靶点序列以及载体插入位置的酶切位点信息合成两条单链gRNA的 oligo片段，如SEQ ID NO：1-2所示，然后经退火后形成带有粘性末端酶切位点的互补双链；

(3)用限制性内切酶Eco31I线性化BKG载体，纯化回收；

(4)用T4 DNA连接酶连接线性化的BKG载体与双链化的gRNA；

(5)转化DH5α大肠杆菌，筛选鉴定阳性克隆，阳性克隆质粒测序，获得正确插入gRNA 的BKG载体。

将上述构建方法获得的载体质粒转化EHA105农杆菌，获得农杆菌侵染性克隆菌株。

本发明基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因的载体可以用于抵御依赖本氏烟寄主 NbbZIP60完成复制侵染的植物病毒的侵染。

本发明基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因的载体可以通过在本氏烟的瞬时表达或遗传转化该载体获得稳定表达材料。

本发明基于CRISPR/Cas9体系编辑本氏烟基因的载体可用于抵御双生病毒的侵染。