[发明专利]一种核酸扩增结果判定方法

说明书

本发明涉及核酸检测技术领域中的一种核酸扩增结果判定方法，包括以下步骤：获取不同循环数的荧光强度数据，并进行曲线拟合，得到拟合函数；根据粒子群优算法计算拟合函数的最优参数，并代入拟合函数，对拟合函数进行一阶导数求解；通过求导计算荧光信号上升或下降的连续次数，并连续次数确定扩增区间；计算二阶导数，得出二阶导数的最大值的解和对应的时间T；判断时间T是否在扩增区间内，若是，则判定时间T即为C_t值，并根据样本定义阈值，判断扩增结果；若否，则根据时间T与扩增区间的位置关系判断扩增结果，具有灵敏度高的优点，突破了实际数据在进行移动平移法时具有滞后性，不能很好反应变化趋势的瓶颈。

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及一种核酸扩增结果判定方法。

背景技术

核酸扩增和检测技术是当今生物学研究的重要手段之一，包括生物技术、基础科学、医学研究等在内的各领域的科学家们用这种方法进行广泛的应用研究。核酸扩增技术包括常规PCR、实时荧光PCR、数字PCR以及目前临床伴随诊断(POCT)技术流行的恒温扩增技术，如LAMP、CPA技术等。这类方法会产生大量的原始数据值，数据处理方法的不同可能会显著的影响最终的结果。

核酸扩增技术常用于用于基因表达的定量分析，或者是常见传染病的定性检测，核酸检测目前是新型冠状病毒检测的“金标准”，具有早期诊断、灵敏度和特异性高等特点。在实时荧光PCR中，模板的定量有两种方法：相对定量和绝对定量。

绝对定量指用已知的标准曲线来推算未知的样本量。分析的结果是给定数量的样品中(给定数量的细胞，每微克总RNA)中核酸的量(拷贝数、微克)。相对定量的分析结果是在相当量的试验组(样品A)和对照组(样品B)中一个靶基因的相对比率(倍数差异)。绝对定量中，未知样本的量(即拷贝数或单位数量)可以通过从已知量的标准品范围中推算得出。为了建立标准曲线，需要已知浓度的模板。模板稀释后，用这些稀释样品作为标准样品，将未知的待测样本和标准样置于同一次实验中进行反应，用稀释的标准样品构建标准曲线，通过推算来确定末知样本中目的基因的量。这与用分子量标记来判定琼脂糖凝胶上未知DNA条带分子量大小的原理相似。

相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化。相对定量分为两种,一是以质量单位作为标准进行相对定量，用质量单位(如纽胞数目或核酸的微克数)而不用参照基因作为标准的优点是，实验设计概念简单，数据数学分析处理简单易学。二是以参照基因作为标准进行相对定量，用参照基因而不用质量单位作为标准。这个方法能准确量化出事材料的使用量，当样本用量受限时比较方便。数据分析主要使用双标曲线法和2^-△△Ct法。

无论是定量实验还是定性实验，数据处理都需要进行其中两部核心步骤，数据噪声过滤和Ct值确认。噪声过滤目前主流的方法有三个步奏，数据平滑、背景扣除和幅度归一化。平滑采用移动平均法，简单的三点移动能够体现曲线的趋势并且抹去一些非特异性的峰值。背景扣除是PCR数据处理中的常见步骤，一般是减去运行中观察最小值，再数据平滑处理后进行基线减法能够有效降低背景噪音。幅度归一化统一了不同样本的中心位置，能够降低批次效应带来的影响。其次，Ct值确认主流是选择通过阈值线与扩增曲线交点确认法，阈值线可以人为设定或者默认设置为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

移动平均法能够体现出扩增曲线的趋势，计算速度快，相对简单，但是对预测实际数据不敏感，具有一定的滞后性，而且并不能总是很好的反应出变化趋势，特别是初始浓度较低的扩增，预测值可能活总停留再过去水平上而无法预计会导致将来更低或者更高的波动。阈值线与扩增曲线交点确认法对阈值线设定区间的噪音敏感。

发明内容

本发明针对现有技术中的缺点，提供了一种核酸扩增结果判定方法，具有灵敏度高的优点，突破了实际数据在进行移动平移法时具有滞后性，不能很好反应变化趋势的瓶颈。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

一种核酸扩增结果判定方法，包括以下步骤：