[发明专利]一种mSEB抗原蛋白的纯化方法

权利要求书

1.一种mSEB抗原蛋白的纯化方法，其特征在于，包括下述步骤：

S1、菌体破碎

将mSEB菌体溶解并破碎，得到菌液A；

S2、澄清过滤

将步骤S1中的菌液A离心，收集上清；将上清进行澄清过滤，得到菌液B；

S3、SPFF柱层析

将步骤S2得到的菌液B采用GE SPFF填料装填层析柱对菌液B进行初级纯化，得到SPFF洗脱液；

S4、SPHP柱层析

将步骤S3得到的SPFF洗脱液采用GE SPHP填料装填层析柱对SPFF洗脱液进行中度纯化，得到SPHP洗脱液；

S5、Phenyl HP柱层析

E1、将SPHP洗脱液用硫酸铵溶液进行稀释；按体积比，SPHP洗脱液：硫酸铵溶液=1：0.5～5.0；所述硫酸铵溶液为20mM PB+3M（NH₄）₂SO₄，其pH为6.0；得到SPHP洗脱液稀释液，待进行下一步纯化；

E2、采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对SPHP洗脱液稀释液进行精细纯化，得到phenyl HP洗脱液；

S6、G25柱层析

采用G25层析柱对phenyl HP洗脱液进行脱盐换液，得到G25层析液；

S7、Q HP柱层析

采用Q HP层析柱对G25层析液进行层析，得到Q HP流穿液；

S8、原液制备

将Q HP流穿液在生物安全柜或无菌隔离器中除菌过滤，得到mSEB蛋白原液；

在步骤S5之前还包括蛋白质复性，所述蛋白质复性的方法为包括在步骤S3中进行SPFF柱层析柱上复性或者在步骤S4中进行蛋白酶辅因子法复性；

当在步骤S3中进行PFF柱层析柱上复性时，

①步骤S3具体为：

层析柱：柱高18～20cm、柱直径200mm、柱体积5.5～6.5L；

流动相A：20mM PB，pH6.0；

流动相B：20mM PB+5mM GSH+0.5mM GSSG，pH6.0；

流动相C：20mM PB+1M NaCl，pH6.0；

上样参数：

上样流速：36～72L/h；紫外检测波长：UV 280nm；上样完成后使用流动相A平衡柱子；

复平衡1参数：

流速：36～72L/h，复平衡2-3个柱体积，待基线走平，使用流动相B进行柱上复性20CV；

流速：3.6～7.2L/h，柱上复性过夜4-20h；次日复性完成后，使用流动相A平衡柱子；

复平衡2参数：

流速：36～72L/h，复平衡1-2个柱体积，待基线走平，开始洗脱；

洗脱参数：流速36～72L/h；梯度为：A：C=0-50%，10个柱体积；

洗脱过程检测UV280吸收图谱，起始收集UV值（mAU）大于600mAU；结束收集UV值（mAU）小于700mAU，得到SPFF洗脱液；

②步骤S4具体为：

D1、将步骤S3得到的SPFF洗脱液稀释2～5倍，得到SPFF洗脱液稀释液；控制SPFF洗脱液稀释液的电导率2.0～8.0 ms/cm ，将SPFF洗脱液稀释液使用高速冷冻离心机离心，离心参数：12000～15000g，2～8℃离心20～30min，收集上清；

D2、上清采用Cobetter 0.22μm滤膜进行减菌过滤，待上柱纯化；

D3、采用GE SPHP填料装填层析柱，对SPFF洗脱液稀释液进行中度纯化，得到SPHP洗脱液；

当在步骤S4中进行蛋白酶辅因子法复性时，

①步骤S3具体为：

SPFF柱层析进行初级纯化时：

层析柱：柱高18～20cm、柱直径200mm、柱体积5.5～6.5L；

缓冲液：

SPFF平衡液：pH6.0～6.5、20-50mM的PB；

SPFF洗脱液：20mM PB+1M NaCl，其pH为6.0；

上样流速：36～72L/h；

复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：36～72L/h，平衡体积：5～8CV，至UV值、电导平稳；

洗脱：洗脱流速36～72L/h，洗脱梯度0～50%B,10CV；

收集标准：当UV280nm=200～600mAU时开始收集峰，当UV280nm=700～200mAU时停止收集，得到SPFF洗脱液；

②步骤S4具体为：

D1、将步骤S3得到的SPFF洗脱液稀释2～5倍，得到SPFF洗脱液稀释液；控制SPFF洗脱液稀释液的电导率2.0～8.0 ms/cm，加入终浓度为1～50μmM的CuSO₄溶液，以50～100 RPM转速搅拌、2～8℃保温4～20h；

D2、将SPFF洗脱液稀释液使用高速冷冻离心机离心，离心参数：12000～15000g，2～8℃离心20～30min，收集上清；

D3、上清采用Cobetter 0.22μm滤膜进行减菌过滤，待上柱纯化；

D4、采用GE SPHP填料装填层析柱，对SPFF洗脱液稀释液进行中度纯化，SPHP柱层析进行中度纯化时，

层析柱：柱高18～20cm、柱直径200mm、柱体积5.5～6.5L；

缓冲液：

SPHP平衡液：pH6.0～6.5、20～50mM的PB；

SPHP洗脱液：20mM PB+1M NaCl，其pH为6.0～6.5；

上样流速：12～24L/h；

复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速12～24L/h；平衡体积：2～5CV，至UV值、电导平稳；

洗脱：洗脱流速12～24L/h，洗脱梯度0～50%B，10CV；

收集标准：当UV280nm=200～600mAU时开始收集峰，当UV280nm=1000～200mAU停止收集，得到SPHP洗脱液。