[发明专利]生产NMN的菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明属于生物技术和生物化工领域，提供了一种生产NMN的菌株的构建方法、根据所述方法构建的菌株以及菌株的利用。其中，所述构建方法包括：(1)构建表达以下基因的质粒，所述基因包括：葡萄糖6‑磷酸异构酶基因Pgi、烟酰胺磷酸核糖转移酶基因Nampt和PPP途径基因，其中所述PPP途径基因包括：葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶基因Zwf、6‑磷酸葡萄糖酸内酯酶基因Pgl、6‑磷酸葡糖酸脱氢酶基因Gnd、核糖‑5磷酸异构酶A基因RpiA、核糖‑5磷酸异构酶B基因RpiB、磷酸核糖焦磷酸激酶基因Prs；(2)将质粒转化至大肠杆菌中，筛选基因转化阳性菌株即得。本发明构建的重组大肠杆菌具有高效制备NMN能力，菌株性能优良，NMN制备简单。

技术领域

本发明属于生物技术和生物化工领域，具体涉及NMN的制备。

背景技术

NMN是β-烟酰胺单核苷酸(β-Nicotinamide mononucleotide)的简称，存在于所有生物体中，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD⁺)的关键前体。近年来的研究表明，通过调节生物体内NMN的水平，可以间接改变NAD⁺水平，从而进一步改善和治疗血管功能障碍以及神经和老化退行性等疾病。此外，NMN还可以通过间接参与和调节机体的内分泌，保护和修复胰岛功能，防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病的发生。在生物体中，NMN和NAD⁺最重要的代谢过程为：由烟酰胺(Nicotinamide，NAM)在烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphate ribose transferase，Nampt)的催化下生成NMN，随后NMN在烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(Nicotinamide mononucleotide adenosinetransferase，Nmnat)的催化下生成NAD⁺并发挥各种生理功能，如激活以NAD⁺为特异性底物的Ⅲ型蛋白赖氨酸脱乙酰酶(Sirtuins)，维持细胞氧化还原状态、调节细胞存活和死亡等。随着NMN医疗保健功能和作用被不断发现和证实，其在医药治疗以及功能食品方面的应用得到国内外研究者的广泛关注。

目前NMN的生产方法大体可以分为三类，即化学合成法、生物酶催化法、发酵法。其中，化学合成法是主要以烟酰胺核糖为原料，用三氯氧磷进行磷酸化得到NMN，存在产品纯度差以及大量有机溶剂的使用对环境破坏严重等问题。生物酶催化法因不残留有机溶剂，也不存在手性问题，并且制备的NMN与机体内的同型，被认为是一种较为绿色环保的方法；但酶促反应底物成本高昂、反应条件苛刻、生产工艺不稳定、批次间产品指标相差大、反应产能低，严重制约了其应用和发展。发酵法以微生物直接发酵，反应条件温和、对环境污染较小、原材料受限小，因而在国内外越来越受到关注；但是，目前微生物发酵生产NMN仍存在一些问题，如菌株NMN合成能力差、产量低、NMN易在合成过程中被降解等，严重影响生产效益。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产NMN的菌株的构建方法，以此方法获得的菌株性能好、NMN产量高。

在第一个方面，本发明提供一种生产NMN的菌株的构建方法，包括如下步骤：

(1)构建表达以下基因的质粒，所述基因包括：葡萄糖6-磷酸异构酶基因Pgi、烟酰胺磷酸核糖转移酶基因Nampt和PPP途径基因，其中所述PPP途径基因包括：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因Zwf、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶基因Pgl、6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因Gnd、核糖-5磷酸异构酶A基因RpiA、核糖-5磷酸异构酶B基因RpiB、磷酸核糖焦磷酸激酶基因Prs；

(2)将质粒转化至大肠杆菌中，筛选基因转化阳性菌株即得；

进一步优选地，所述质粒还包括烟酰胺核糖转运蛋白基因Pnuc。

其中，所述Nampt基因源自鲍曼不动杆菌、杜克雷嗜血杆菌、埃氏希瓦氏菌及松噬几丁质菌等细菌；优选地，所述Nampt源自松噬几丁质菌；