[发明专利]一种斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种斜带石斑鱼抗菌肽NK‑Lysin成熟肽重组蛋白制备方法和应用，通过编码斜带石斑鱼抗菌肽NK‑Lysin基因的ORF获得斜带石斑鱼抗菌肽NK‑Lysin成熟肽蛋白，并利用斜带石斑鱼抗菌肽NK‑Lysin成熟肽蛋白构建能够大量表达斜带石斑鱼抗菌肽NK‑Lysin成熟肽重组蛋白的重组毕赤酵母GS115菌株，获得的斜带石斑鱼抗菌肽NK‑Lysin成熟肽重组蛋白纯化后能够制备抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性菌的水产养殖饲料添加剂或抗菌药物或日化用品添加剂。

技术领域

本发明涉及生物技术制药工业中基因工程领域，特别是一种斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白制备方法和应用。

背景技术

斜带石斑鱼NK-Lysin蛋白是一种抗菌肽，结构非常保守，属于鞘脂激活蛋白样蛋白(saposin-like proteins，SALIP)家族成员。研究显示，该蛋白由白细胞介素2激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤(NK)细胞产生，可以有效抵御致病菌感染，提高机体免疫功能。NK-Lysin蛋白是由5个外显子和4个内含子组成，具有非常保守的鞘脂激活蛋白B结构域和6个半胱氨酸，同时这6个半胱氨酸两两配对(C1-C6；C2-C5；C3-C4)形成特殊的内二硫键结构，使得该蛋白可以有效的附在细胞膜上形成孔，有效穿过微生物的脂质双层膜，进入细胞内部，杀灭细菌。

近些年来，采用原核表达系统生产基因工程药物已经非常成熟，但抗菌肽对细菌具有杀灭作用，不适用于原核表达系统直接表达抗菌肽。因此，本研究采用真核表达菌株酵母菌作为基因工程受体菌，酵母菌具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力，并且不会产生内毒素，是基因工程中良好的真核基因受体菌。

因此，本技术方案将斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin蛋白作为外源基因，成功转化入酵母，利用酵母表达抗菌肽，可以有效降低成本，提高产量，如后期能在表达产率上得到进一步提高，将及早实现抗菌肽进入临床应用，解决市场需求。

发明内容

本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白制备方法和应用。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

一种斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin基因，以斜带石斑鱼组织cDNA为模板进行PCR扩增获得，所述斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin基因的ORF序列如SEQ ID NO.1所示。以斜带石斑鱼NK-Lysin基因ORF序列为模板，克隆出斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白序列，其序列如SEQ ID NO.2所示。

作为本发明的以另一种实施方案，一种制备斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白的方法，包括以下步骤：

1)构建斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的表达重组载体；

2)制备毕赤酵母GS115菌株感受态细胞；

3)将斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的表达重组载体酶切线性化后电击导入毕赤酵母GS115菌株感受态细胞，筛选出斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白重组毕赤酵母GS115菌株；

4)将斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白重组毕赤酵母GS115菌株经过摇瓶发酵和甲醇诱导表达及纯化，获得高纯度斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白。

进一步地，所述步骤1)具体包括：