[发明专利]一种斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白制备方法和应用

权利要求书

1.一种斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin基因，其特征在于：以斜带石斑鱼组织cDNA为模板进行PCR扩增获得，所述斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin基因的ORF序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白，其特征在于，以斜带石斑鱼NK-Lysin基因ORF序列为模板，克隆出斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白序列，其序列如SEQ IDNO.2所示。

3.一种制备如权利要求2所述的斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白的方法，包括以下步骤：

1）构建斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的表达重组载体；

利用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ限制性内切酶Takara Bio对表达成熟肽蛋白的核苷酸序列纯化后的PCR产物和pPIC9K质粒，同时进行双酶切，37℃水浴处理4h，酶切后产物经琼脂糖凝胶电泳检测，酶切完全，并利用琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒回收目的片段，利用T4 DNA连接酶Takara Bio16 ℃水浴过夜处理，重组载体导入TOP感受态细胞中，阳性克隆后进行测序，筛选测序正确后的菌株，摇瓶大量培养，使用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒备用；构建成功的斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的表达重组载体命名为pPIC9K/NK-Lysin；

2）制备毕赤酵母GS115菌株感受态细胞；

挑取毕赤酵母GS115单菌落接种于10 mL YPD 培养基，置于 30 ℃、250 rpm 振荡过夜培养；吸取活化后的菌液加入到新鲜的100 mL YPD 液体培养基中，重新置于 30 ℃、250rpm 振荡培养至 OD600值达到1.3-1.5；取该培养液在4 ℃、5000 rpm 离心 5 min，弃上清，扣干离心管壁，加入50 mL冰预冷无菌水振荡重悬菌体，然后4 ℃、5000 rpm离心5 min，弃上清，吸干管壁残余液体；加入20 mL、1 mol/L 冰预冷的无菌山梨醇溶液重悬菌体，然后4℃、5000 rpm 离心5min，弃上清，吸干管壁残余液体；最后加入200 μL 冰预冷的无菌山梨醇溶液振荡混匀，分装成100 μL/管，-80 ℃冰冻保存即得毕赤酵母GS115菌株感受态细胞；

3）将斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的表达重组载体酶切线性化后电击导入毕赤酵母GS115菌株感受态细胞，筛选出斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白重组毕赤酵母GS115菌株；

将斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的表达重组载体用Sal Ⅰ酶切线性化，胶回收目的片段；将上述制备的液体分别加入到预冷 0.2 cm 的电转杯中，混匀后置于冰上 10min，然后在电转仪中进行电击，电击条件：1500 V，5 ms，立即取 1 mol/L 山梨醇 500 μL加入到电转杯中，吸取 200 μL 涂布在 MD 平板上 30 ℃培养 3-5 d，取200μL毕赤酵母GS115菌株感受态细胞涂布到MD平板上培养，获得重组毕赤酵母GS115菌株pPIC9K/NK-Lysin-GS115；

用灭菌牙签挑取MD平板上长出的单菌落递进接种到含有浓度梯度为1、2、3、4、5 mg/mL的G418-YPD平板上，置于30 ℃培养 2-3 d，挑取能在5 mg/mL 的G418-YPD 平板上长出来的单菌落扩大培养，用酵母基因组DNA快速抽提试剂盒提取基因组DNA，利用pPIC9K质粒通用引物进行PCR扩增，鉴定Mut⁺ 或Muts表型，Mut⁺表型的菌株即为重组毕赤酵母GS115菌株；

4）将斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白重组毕赤酵母GS115菌株经过摇瓶发酵和甲醇诱导表达及纯化，获得高纯度斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白；

重组毕赤酵母GS115菌株接种于25 mL BMGY 液体培养基中，置于30 ℃、250 rpm振荡培养至OD600值达到2~6；4 ℃、5000 rpm 离心 5 min，弃上清，重悬菌体转移至1L锥形瓶，加入0.5%~1.0%甲醇，盖上两层灭菌纱布，30 ℃、250rpm诱导表达96 h，诱导过程中每24 h添加一次甲醇，斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白将分泌至培养液中，提取斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白后进行纯化获得高纯度斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白。

4.如权利要求2所述的斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白在制备抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性菌的水产养殖饲料添加剂或抗菌药物或日化用品添加剂中的应用。