[发明专利]一种电化学生物传感器及其应用

权利要求书

1.一种电化学生物传感器，其特征在于，采用多孔UIO-66-NH₂作为纳米容器负载电活性碱性染料-NR、TB、TMB和MG，具体为NR@UiO-66 、TB@UiO-66、TMB@UiO-66、MG@UiO-66)。

2.如权利要求1所述电化学生物传感器，其特征在于，其制备方法包括：

（1）UIO-66-NH₂的制备：将215 mg氨基对苯二甲酸和75 mg氯化锆溶解在20 mL DMF和1.5 mL乙酸的混合溶液中，超声15分钟；将混合溶液转移到反应器中，在120℃的高温下水热反应8小时；反应结束后，自然冷却至室温的UiO-66-NH2产物干燥，10000rpm离心10min；

然后用无水乙醇洗涤产物并真空干燥；

（2）吸附电活性染料：取5mgUiO-66-NH₂纳米颗粒分别与25 mL染料-NR、TB、TMB和MG混合物的溶液将20 mg/L的浓度（每种染料10 mg/L）混合，得到NR@UiO-66 、TB@UiO-66、TMB@UiO-66、MG@UiO-66；在25℃下吸附三小时后，吸附剂被分离，UV-Vis进行光谱分析以确定染料浓度；

（3）修饰抗体：将1 mL的0.1 M EDC（1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺）分别加入1 ng/mL的200 ul HER2、ER、Ki67和PR抗体溶液中（用PBS溶液稀释原液得到）；EDC与抗体的羧基反应，在室温下30分钟内产生活性酯中间体；之后，将0.1M NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）和0.015 g NR@UiO-66 、TB@UiO-66、TMB@UiO-66、MG@UiO-66；重新悬浮到上述相应的溶液中，使 UiO-66-NH₂在4℃搅拌16小时；然后将溶液离心，再分别用0.01 M PBS洗涤六次；离心后，未反应的基团用BSA（牛血清蛋白）溶液封闭，用PBS缓冲液洗涤，得到HER2-antibody@NR@UiO-66、ER-antibody@TB@UiO-66、Ki67-antibody@TMB@UiO-66、PR -antibody@MG@UiO-66探针；最后将上述四种UiO-66探针混合后放入冰箱冷藏备用。

3.电化学生物传感器的应用，其特征在于，采用权1或权2所述电化学生物传感器用于血清中识别雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子受体-2（HER-2）和细胞增殖生物标志物（Ki-67)四种生物标志物。

4.如权利要求3所述电化学生物传感器的应用，其特征在于，用于血清中识别所述四种生物标志物以及对乳腺癌分子分型诊断的方法，包括如下步骤：

（1）将ITO电极逐渐放入洗涤剂溶液（8g/L）、异丙醇、丙酮和超纯水中20分钟，确保电极表面清洁干净；然后将ITO电极浸入氢氧化钠溶液（1mM）中，室温浸泡5小时，使电极表面带负电；再次用超纯水超声20分钟，用氮气吹干，保存备用；

（2）混合10 μL四种不同浓度的染料@MOF材料样品，加入100pg/mL HER2、ER、PR和Ki67四种目标蛋白，混合液37℃孵育60分钟；离心后，再分散于等体积的PBS溶液中，然后加入三电极体系（氯化银作为参比电极，铂丝作为对电极，ITO作为工作电极），以-0.3 V，200 s为周期进行扫描；再利用电化学工作站测量ITO电极表面的DPV信号，观察蛋白质浓度对SWV信号的影响；

（3）将10ul含有所述四种生物标志物的血清样品稀释在90ul的0.01M PBS溶液中，进行检测，电化学测量程序与上述四种生物标志物检测的程序一致。