[发明专利]瓦伦西亚烯氧化酶突变体及其在制备圆柚酮中的应用

说明书

本发明公开一种瓦伦西亚烯氧化酶突变体及其在制备圆柚酮中的应用。本发明通过定点突变技术构建了HPO突变体的基因文库，通过静息细胞体外催化实验测定，在相同条件下，最优HPO突变体(HPO_G302G‑V480A‑V482A‑A484A，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示)的催化效率是野生型催化效率的2.54倍，从而加大对底物的利用效率，提高目标化合物圆柚酮的产量。同时，本发明所述圆柚酮的生物制备方法，具有操作简便，对环境友好，反应条件温和等优点，具有很好的应用前景。此外，本发明也是第一个成功构建高产圆柚酮的HPO有益突变体的报道。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及了一种氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示的瓦伦西亚烯氧化酶(HPO)突变体及其重组表达细胞在生物法制备圆柚酮中的应用，涉及编码所述酶的核酸序列、包含所述编码核酸序列的重组表达载体及用于制备圆柚酮的方法。

背景技术

圆柚酮(Nootkatone)，也叫诺卡酮等，最早是从阿拉斯加黄扁柏(Callitropsisnootkatensis)芯材中分离得到的，也普遍存在于葡萄柚、甜橙等水果中。因其具有浓烈且持久的带有木质香气的柑橘果香，由此成为食品和香料行业高价值和高需求的芳香化合物。此外，圆柚酮还是一种有效且环保的驱虫剂，可以驱除蚊子、蜱虫等昆虫。近年发现圆柚酮及其衍生物还有抑制癌细胞增殖、抗血小板凝集、激活能量代谢等生理活性，因此也是潜在的药物前体分子。

然而，受限于从天然来源中提取这种化合物的成本高昂且产量不足。因此，在工业生产中通常是采用氧化廉价且大量可用的瓦伦西亚烯(Valencene)制备圆柚酮。然而，化学氧化方法不可避免的依赖于不安全的试剂，如过乙酸叔丁酯、三氧化铬、铬酸叔丁酯或其他一些重金属盐类，且对环境造成严重的危害(Hunter GLK,et al.Conversion ofvalencene tonootkatone[J].Journal of Food Science,1965,30(5):876-878.)。近年来，得益于合成生物学领域的飞速发展，采用生物技术催化瓦伦西亚烯生成圆柚酮已成为新的探索方向与研究趋势。

2007年，Shunji Takahashi等从天仙子(Hyoscyamus muticus)的细胞悬浮培养物中，分离得到一种可以催化瓦伦西亚烯的烯丙基C-2位羟基化的酶(NCBI登录号为EF569601.1)，该酶英文全称为Hyoscyamus muticus premnaspirodiene oxygenase，简称为HPO，这是文献首次发掘HPO并对其进行功能表征。后续陆续有研究发现并证实，HPO确实具备催化瓦伦西亚烯羟基化生成圆柚醇的功能，2020年，Xiangfeng Meng等发现在酿酒酵母W303-1A菌株中，共表达瓦伦西亚烯合成酶(CnVS，NCBI登陆号为JX040471)、HPO、AtCPR(HPO的氧化还原伴侣，NCBI登录号为NM_118585)、来自红球姜(Zingiber zerumbet)的醇脱氢酶ZSD1(NCBI登录号为AB480831)，可以实现圆柚酮的从头合成，但是产量仅为59.78mg/L，与此同时，发酵液中残留大量瓦伦西亚烯(Meng X,et al.Metabolic engineeringSaccharomyces cerevisiae for de novo production of the sesquiterpenoid(+)-nootkatone[J].Microbial Cell Factories,2020,19.)。由此可见，囿于这一过程中的关键限速酶，即HPO的表达水平和催化能力不足，尤其是在较高瓦伦西亚烯浓度时其催化活性受到抑制，圆柚酮依然面临严峻的产量瓶颈的问题。