[发明专利]一种用于表达抗体IgG1的rAAV载体及其应用

说明书

本发明公开了一种用于表达抗体IgG1的rAAV载体及其应用。所述rAAV载体ITR核心表达元件由广谱强启动子CMV、IgG1重链分泌信号肽序列、IgG1重链编码区、连接多肽编码序列、IgG1轻链分泌信号肽序列、IgG1轻链编码区和人血清白蛋白多聚腺苷酸序列构成。通过上述rAAV载体上的酶切位点可以方便快速地对重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）进行操作。利用包装获得的抗体IgG1‑rAAV病毒感染体外培养的HEK293T细胞或C57小鼠等，能够表达具有不同抗原识别活性的各种抗体IgG1。

技术领域

本发明属于病毒载体技术领域，更具体地，涉及一种可长效表达抗体的rAAV载体及其应用。

背景技术

单克隆抗体(mAb)的疗法是治疗免疫疾病，癌症和传染病的非常成熟的策略之一。当前获得许可的治疗性mAb大部分都是IgG1型抗体，它由两个二聚体组成的四聚体形成，每个二聚体包含通过二硫键组装在一起的轻链(Light Chain，LC)和重链(Heavy Chain，HC)。MAb具有赋予抗原结合特性的可变片段(Fab)和恒定片段(Fc)。除了结合外，mAb还可以通过Fab相互作用中和病毒，也可以参与针对特定抗原的免疫应答。Fc与Fc细胞受体的作用可以触发不同的机制，包括程序性细胞死亡，免疫细胞募集和补体级联的激活(Vidarsson等,Front Immunol,2014,5:520.)。因此，mAb的双重功能对于实现其治疗效果非常重要。

重组腺相关病毒载体(rAAV)具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广、病毒血清型种类多、可感染分裂和非分裂细胞、能介导外源基因在动物体内长期稳定表达等特点，是一种用于携载外源基因表达的重要病毒载体工具。rAAV载体一般是用外源基因表达元件替换AAV编码基因，仅保留病毒复制和包装所需的ITR序列。通过反式补偿Rep、Cap基因和辅助病毒功能因子，就可在某些细胞系中包装产生出携带外源基因的rAAV载体。rAAV载体已被用于介导编码单克隆抗体(mAb)基因，在体内获得长期表达，从而减少了传统单克隆抗体注射液给药次数，可在数月至数年内有效抵抗慢性和感染性疾病，如：呼吸道合胞病毒，人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)和流感病毒等(Robert等，Current Gene Therapy,2016,16,363-374)。rAAV携载外源基因片段的大小的能力一般不超过5Kb。使用两个rAAV病毒分别表达IgG1的轻链和重链虽然受rAAV包装容量的限制较小，但两个rAAV共感染单个靶细胞表达产生完整IgG1抗体的水平往往并不理想。因此，利用单个rAAV表达IgG1抗体的策略成为了更好的选择。利用两套启动子与polyA表达框分别表达IgG1的轻链和重链，但容易造成片段长度超限导致rAAV产率下降。利用核糖体内部进入位点(IRES)表达IgG1的轻链，省去了一套启动子与polyA表达框，降低片段的长度，但由于IgG1的重链和轻链的表达受不同的启动子或IRES调节元件控制，往往造成重链和轻链的起始表达不是相同的比例，这并不是产生IgG1的最佳选择。有研究者利用口蹄疫病毒(FMDV)的自剪切多肽(F2A)替代IRES，可以使IgG1的重链和轻链等比例表达。进一步还有使用氟林蛋白酶切位点(Furin)去除F2A自剪切多肽链切割后残留多余氨基酸可以改善抗体的稳定性，通过该策略获得的抗体最高血清浓度可达到1mg/ml的治疗水平(Fang等，Nat Biotechnol 2005；23:584-90.)。然而，上述连接多肽的剪切效率并不是很高，IgG1的表达水平也仍有待进一步提高。目前，仍然缺乏有效的表达识别不同抗原IgG1的通用IgG1-rAAV载体。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明一方面提供了一种用于表达抗体IgG1的rAAV载体，rAAV载体ITR核心表达元件由广谱强启动子CMV、IgG1重链分泌信号肽序列、IgG1重链编码区、连接多肽编码序列(linker)、IgG1轻链分泌信号肽序列、IgG1轻链编码区和人血清白蛋白多聚腺苷酸(HGHpA)序列构成。

优选地，所述的连接多肽编码序列由优化的弗林蛋白酶切割位点(Opt-Furin)序列RRKR与自剪切肽2A(T2A)组成，序列如SEQ ID NO.4所示。