[发明专利]一种pProTB质粒、其构建方法及应用

说明书

本发明涉及一种pProTB质粒、其构建方法及应用，属于质粒构建技术领域。所述pProTB质粒的构建方法，包括如下步骤：步骤1：构建HygroR‑luciferase载体；步骤2：构建pProTB质粒；步骤3：验证pProTB质粒是否构建成功。本发明还公开了一种pProTB质粒及其应用。本发明构建得到的pProTB质粒，整合了HygroR、TagBFP和Fluc三种基因的优点，一是可以通过HygroR筛选阳性细胞，可用于细胞药物筛选；二是可以通过TagBFP对细胞进行筛选或者鉴定药物筛选阳性的细胞；三是可以通过Fluc在活体动物中追踪该质粒转染的细胞。

技术领域

本发明涉及一种pProTB质粒、其构建方法及应用，属于质粒构建技术领域。

背景技术

潮霉素B抗性基因(HygroR)能够构建在多种载体上，通过潮霉素B(HygroR)筛选转染HygroR抗性基因阳性细胞，从而筛选到目的细胞，这项技术广泛应用与医学生物研究领域。不过潮霉素B筛选后会出现部分耐药细胞，达不到精确筛选阳性细胞的目的，影响研究结果的准确性。

蓝色荧光蛋白(TagBFP)可以通过对细胞进行标记从而追踪细胞，在生物和医学研究中有广泛的应用。不过，该项技术通常需要使用流式细胞仪，很多实验室可能不具备开展这项实验的条件，而且，使用TagBFP在活体动物中进行细胞追踪获得的图像背景信号信噪比高，因此定量检测性能差。

萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase,简称FLuc)可以在活体动物中进行细胞追踪，获得的图像背景信号信噪比低，适用于活体动物定量研究。但缺点是没有药物抗性，不能进行流氏分选从而筛选细胞，另外FLuc只有在活细胞内才会产生发光现象，且发光光强度与标记细胞的数目线性相关。

综上，如何克服HygroR筛选后出现耐药细胞，TagBFP需要特定设备和无法在活体动物体内进行精确定量追踪，以及Fluc不能筛选细胞的缺点？目前尚未有将HygroR、TagBFP和Fluc这三种基因构建在一起的质粒的报道。

发明内容

本发明的目的之一，是提供一种pProTB质粒的构建方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种pProTB质粒的构建方法，包括如下步骤：

步骤1：构建HygroR-luciferase载体

步骤1.1：取HygroR抗性基因，进行PCR扩增反应，得到HygroR PCR扩增产物；将HygroR PCR扩增产物进行酶切，得到HygroR酶切反应液；将HygroR酶切反应液再纯化，得到HygroR酶切产物；

步骤1.2：将Fluc载体进行酶切，得到Fluc载体酶切反应液；将Fluc载体酶切反应液再纯化，得到Fluc载体酶切产物；

步骤1.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤1.1得到的HygroR酶切产物和步骤1.2得到的Fluc载体酶切产物，得到质粒HygroR-luciferase；

步骤1.4：将质粒HygroR-luciferase转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到HygroR-luciferase载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤2：构建pProTB质粒

步骤2.1：取TagBFP载体，进行PCR扩增反应，得到TagBFP PCR扩增产物；将TagBFPPCR扩增产物进行酶切，得到TagBFP酶切反应液；将TagBFP酶切反应液再纯化，得到TagBFP酶切纯化产物；

步骤2.2：将步骤1.4得到的HygroR-luciferase载体进行酶切，得到HygroR-luciferase酶切反应液；将HygroR-luciferase酶切反应液再纯化，得到HygroR-luciferase酶切纯化产物；