[发明专利]一种pProTB质粒、其构建方法及应用

权利要求书

1.一种pProTB质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：构建HygroR-luciferase载体

步骤1.1：取HygroR抗性基因，进行PCR扩增反应，得到HygroR PCR扩增产物；将HygroRPCR扩增产物进行酶切，得到HygroR酶切反应液；将HygroR酶切反应液再纯化，得到HygroR酶切产物；

步骤1.2：将Fluc载体进行酶切，得到Fluc载体酶切反应液；将Fluc载体酶切反应液再纯化，得到Fluc载体酶切产物；

步骤1.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤1.1得到的HygroR酶切产物和步骤1.2得到的Fluc载体酶切产物，得到质粒HygroR-luciferase；

步骤1.4：将质粒HygroR-luciferase转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到HygroR-luciferase载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤2：构建pProTB质粒

步骤2.1：取TagBFP载体，进行PCR扩增反应，得到TagBFP PCR扩增产物；将TagBFP PCR扩增产物进行酶切，得到TagBFP酶切反应液；将TagBFP酶切反应液再纯化，得到TagBFP酶切纯化产物；

步骤2.2：将步骤1.4得到的HygroR-luciferase载体进行酶切，得到HygroR-luciferase酶切反应液；将HygroR-luciferase酶切反应液再纯化，得到HygroR-luciferase酶切纯化产物；

步骤2.3：使用T4 DNA连接酶，连接步骤2.1得到的TagBFP酶切纯化产物和步骤2.2得到的HygroR-luciferase酶切纯化产物，再转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态，挑选阳性克隆，经测序验证，得到TagBFP-HygroR-luciferase载体，即为pProTB质粒，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；

步骤3：验证pProTB质粒是否构建成功

将步骤2构建的pProTB质粒转染人肾上皮细胞系293T，验证pProTB质粒是否构建成功。

2.根据权利要求1所述的pProTB质粒的构建方法，其特征在于，步骤1.1中，所述HygroRPCR扩增反应的体系为：10xBuffer 5μl,2mM dNTPs 5μl,25mM MgSO₄ 2μl,10pmol/μl的SEQID NO.3所示的正向引物1.5μl,10pmol/μl的SEQ ID NO.4所示的反向引物1.5μl,模板DNA50ng,1.0U/μl的KOD Plus酶1μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；反应程序为：94℃初始变性2min；94℃变性15s，68℃延伸1min，重复25次；68℃延伸10min,4℃，无限循环；

所述HygroR PCR扩增产物进行酶切的反应体系为：10×CutSmart Buffer 5μl，HindⅢ酶1μl，BglII酶1μl，HygroR PCR扩增产物30μl和余量为蒸馏水，总体系为50μl；将上述反应体系置于37℃水浴锅1h，得到HygroR酶切反应液；

所述纯化的具体方法是：

(1)吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CA2重新放回收集管中；

(2)HygroR酶切反应液凝胶中加入500μl结合液PB，50℃充分混匀，得到混合液；

(3)将混合液转入平衡过的吸附柱CA2中，室温放置2min后，离心，加入，12000rpm离心1min；600μl漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心1min，共离心2次,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放回收集管中；

(4)室温晾干，加入30μl-50μl的ddH₂O溶解，即得到酶切HygroR酶切产物。