[发明专利]一种熊去氧胆酸的制备方法

权利要求书

1.一种熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：将7α-羟基类固醇脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶四个酶构建在同一个共表达质粒pRSFDuet-1上，转化BL21-DE3表达宿主，发酵转化底物鹅去氧胆酸，生成熊去氧胆酸。

2.根据权利1要求所述的一种熊去氧胆酸制备方法，其特征在于，所述7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶分别来源于大肠杆菌和活泼瘤胃球菌，乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶分别来自乳酸杆菌和芽孢杆菌，基因合成均为已优化的密码子。

3.根据权利1要求所述的一种熊去氧胆酸制备方法，其特征在于：

①四个酶共表达质粒pRSF-GDH-7β-LDH-7α的构建方式为：首先分别构建2个双酶共表达质粒pRSF-LDH-7α和pRSF-GDH-7β，再通过重叠延伸PCR将LDH-7α和GDH-7β两个基因片段拼接在一起，新的基因片段GDH-7β-LDH-7α通过酶切连接的方式连接到共表达质粒pRSFDuet-1上；

②验证正确的四酶共表达质粒pRSF-GDH-7β-LDH-7α，转入BL21-DE3表达菌株，得到工程菌，得到转化鹅去氧胆酸的大肠杆菌；

③鹅去氧胆酸的全细胞催化方法：首先通过发酵培养并诱导表达，得到高密度的工程菌发酵液，通过外源补加转化底物鹅去氧胆酸、丙酮酸钠和葡萄糖，继续诱导培养，最终得到熊去氧胆酸；

④熊去氧胆酸粗品纯化方法：发酵液调酸收集全部沉淀后甲醇提取产物中的熊去氧胆酸或直接在发酵液中用甲醇提取熊去氧胆酸，经过降温析晶，得到熊去氧胆酸粗品，再经过两次丙酮-水精制，最终可得到＞99.8高纯度的熊去氧胆酸精品。