[发明专利]一种霍氏鲍特菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种霍氏鲍特菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，所述MNP标记位点是指在霍氏鲍特菌基因组上筛选的区分于其他物种且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括MNP‑1～MNP‑16的标记位点；所述引物如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.32所示。所述MNP标记位点能特异的鉴定霍氏鲍特菌并精细的区分不同的亚型；所述引物互不干扰，综合多重扩增和测序技术，可一次性对多样本的所有标记位点进行序列分析，具有高通量、多靶点、高灵敏和免培养的检测优势，可应用于大规模样本的霍氏鲍特菌的鉴定和遗传变异检测，对霍氏鲍特菌的科研和医学监测具有重要意义。

技术领域

本发明实施例涉及生物技术领域，特别涉及一种霍氏鲍特菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

霍氏鲍特菌(Bordetella holmesii)属于鲍特菌属，是一类能够产棕色色素的革兰氏阴性小杆菌，其严格需氧、不分解糖类且营养要求高。霍氏鲍特菌通常在免疫缺陷综合征或无脾患者中引起侵袭性感染，如关节炎、菌血症、脑膜炎、心内膜炎等，而对于健康个体则一般引起上呼吸道症状。百日咳是由百日咳鲍特菌感染引起的一种严重急性呼吸道传染病，有研究表明，霍氏鲍特菌也可引起类似百日咳样症状。由于对其缺乏足够的认识和实验室鉴别方法，因此经常被误诊为百日咳鲍特菌。多地流行病学调查证实，不同地区人群中，霍氏鲍特菌引起的百日咳发病率在0％～29％不等，青少年和成人发病率更高。因此，快速、准确、特异的鉴定霍氏鲍特菌的检测对于精准治疗具有重要意义。另外，霍氏鲍特菌也是实验室进行研究常用的模式生物。霍氏鲍特菌的遗传变异会导致不同实验室或同一实验室不同时期相同命名的菌株实际上并不相同，导致实验结果的不可重现和不可比较。人Hella细胞实验室间的异质性已经导致大量的实验结果的不可比较和数据浪费。因此，开发快速、准确的、可监测变异的霍氏鲍特菌检测分析方法对于霍氏鲍特菌的科学研究和应用都具有重要意义。

目前霍氏鲍特菌的实验室诊断方法主要包括细菌培养和鉴定,核酸检测和血清学试验等,其中最常用的是基于特异性聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的核酸检测。随着测序技术的发展，全基因组和宏基因组测序在不同的样本检测中也在使用。这些已有的技术在时长、操作复杂度、检测通量、检测变异的准确性和灵敏度、成本等方面存在一个或多个局限。融合超多重PCR扩增和高通量测序的靶向分子标记检测技术，可以在低微生物含量的样本中靶向的富集目标微生物，避免了全基因组依赖于病原菌的分离培养和宏基因组测序带来的大量数据浪费和背景噪音的局限，具有样本需要量少、诊断结果精确，节约数据量、检测低频变异和免培养的优势。现有的靶向检测技术检测的分子标记主要包括SNP和SSR标记。SSR标记是公认的多态性最高的标记，但在微生物中数量少；SNP标记数量巨大，分布密集，是二态性标记，单个SNP标记的多态性不足以捕获微生物种群中潜在的等位基因多样性。因此，开发病原微生物霍氏鲍特菌的高多态性的新型分子标记及其检测技术，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明目的是提供一种霍氏鲍特菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，可以对霍氏鲍特菌进行定性鉴定和变异检测，具有多靶标、高通量、高灵敏和精细分型的效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供了一种霍氏鲍特菌的MNP标记位点，所述MNP标记位点为在霍氏鲍特菌基因组上筛选的物种特异的、且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括CP043146基因组上MNP-1～MNP-16的标记位点。

上述技术方案中，MNP-1～MNP-16的标记位点具体如说明书表1所示，表1中标注的所述MNP标记的起始和终止位置是基于CP043146序列确定的。

在本发明的第二方面，提供了一种用于检测所述MNP标记位点的多重PCR引物组合物，所述多重PCR引物组合物包括16对引物，所述16对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.32所示。