[发明专利]一种高产D-泛酸的基因工程菌及其应用

说明书

本发明公开一种高产D‑泛酸的基因工程菌及其应用，本发明通过回补底盘菌DPA11已经敲除的ilvA基因，利用起始密码子TTG替换ilvE的起始密码子GTG，利用Trc启动子替换serA、glyA、ilvB、ilvN、pntA、pntB和cyo的原始启动子，再在质粒上异源过表达来源于谷氨酸棒状杆菌的panB和panC，得到D‑泛酸高产的大肠杆菌基因工程菌株，该菌株在摇瓶水平上D‑泛酸的产量达到了6.81g/L，是原始出发菌株的3.83倍，并且避免了外源添加异亮氨酸，节约成本，同时发酵罐放大培养节约大量的时间成本。

(一)技术领域

本发明涉及一种高产D-泛酸的基因工程菌及其构建方法，以及该工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。

(二)背景技术

D-泛酸又可称之为维生素B5，是一种重要的水溶性维生素，在生物体内起着重要的生理作用，是辅酶A和酰基载体蛋白(ACP)的重要合成前体。D-泛酸及其衍生物在食品、医药、饲料、化妆品等领域有广泛的应用。在食品领域，D-泛酸可作为一种食品营养强化剂可用于多种食品添加以补充营养成分；在医药方面，D-泛酸作为人体必需的维生素普遍存在于生物体内，其衍生物D-泛酸钙的单方制剂可用于治疗D-泛酸缺乏症，与其他组分构成的复方制剂可用于治疗神经炎、神经衰弱、术后肠绞痛和呼吸道等疾病，同时也可用于多种保健食品等；在饲料方面，饲料中添加一定剂量的D-泛酸能满足猪、鸡和鱼类等生长发育、脂肪代谢的需求，避免出现生长迟缓、适应性及抗病性下降、生殖系统障碍、毛发脱落的现象；在化妆品方面，D-泛酸及其衍生物D-泛醇与皮肤、毛发的营养状态息息相关，可用于防治毛发干枯和损伤，提高毛发营养使其光线亮泽。并且有增加保湿和抗老化的作用，促进皮肤对营养成分的吸收，广泛应用与保湿霜、护发液和乳液等化妆品。

目前生产D-泛酸的方法主要有三种：化学合成法，酶催化法和发酵合成法。化学合成法，先通过化学法制备得到前体物β-丙氨酸和D,L-泛解酸内酯，再合成D-泛酸。其中的β-丙氨酸主要通过丙烯腈法、丙烯酸法和琥珀酸亚胺法合成得到，而D,L-泛解酸内酯主要通过异丁醛-甲醛法、异丁醛-醛乙酸法和异丁醛-三氯甲烷法制备得到，但是法学法高耗能、对设备损耗大，同时产生对人体和环境的有害物质。得到上述中间体后，其中β-丙氨酸用氢氧化钙处理形成β-丙氨酸钙，β-丙氨酸钙再跟D,L-泛解酸内酯在甲醇溶液和高温下发生酰化反应得到D，L-泛酸钙，在通过物理拆分得到高纯度的D-泛酸钙。另一种拆分方法是先对D,L-泛解酸内酯拆分，D,L-泛解酸内酯的拆分方法又包含化学拆分法和酶法拆分，其中化学拆分主要采用奎宁、麻黄素、L-亮氨酸、L-1-对硝基甲苯-2-氨基-1,3-丙二醇等拆分试剂对D,L-泛解酸内酯拆分。酶法拆分主要使用L-泛解酸内酯水解酶、D-泛解酸内酯水解酶、酮泛解酸还原酶和醇脱氢酶等对D,L-泛解酸内酯进行拆分。得到的D-泛解酸内酯后，在将其跟β-丙氨酸钙在甲醇溶液和高温条件下进行酰化反应得到D-泛酸钙。酶法合成D-泛酸，利用微生物来源的泛酸合成酶，以D-泛解酸和β-丙氨酸为底物完成D-泛酸的合成，但是其前体物D-泛解酸和β-丙氨酸仍需要化学合成得到。

随着对微生物代谢过程的不断了解和代谢工程技术的日益发展，使用葡萄糖作为廉价的原料来生产D-泛酸在内的高附加值产品具有广阔的应用前景。但是，由于野生型菌株的自身原因，细胞内合成D-泛酸的途径受限，所以发酵法生产D-泛酸最重要的是得到适当的D-泛酸高产菌株。在代谢改造过程中，由于不同的代谢途径之间存在非线性的关系，以及辅因子的与中心代谢途径的竞争和协作关系，需要从多个维度改造目的代谢途径。