[发明专利]一种改性聚合物微球、制备方法及其在固定化酶领域中的应用

说明书

本发明提供一种改性聚合物微球、制备方法及其在固定化酶领域中的应用，属于固定化酶制备技术领域，本发明分为以下步骤：第一步，通过自稳定沉淀聚合方法制备带吸电子基团的聚合物微球；第二步，在微球表面修饰有螯合配体基团；第三步，利用吸电子基团螯合过渡金属离子得到可以负载酶的改性微球材料；第四步，在微球材料表面固定化带His标签的蛋白酶。本发明用简单的振荡方法固定化酶，反应条件简单温和，同时实现了纯化和固定化过程。固定化提高了酶的相对活性和稳定性，制备得到的固定化酶结合牢靠，可进行多次酶催化反应。

技术领域

本发明属于固定化酶的制备技术领域，具体涉及一种改性聚合物微球、制备方法及其在固定化酶领域中的应用。

背景技术

酶是一种重要的生物催化剂，由于其底物选择性高、催化效率高、反应条件温和等优点，在食品工业、生物催化、皮革工业、生物传感器、生物柴油等领域得到了广泛的应用，但是酶制剂存在稳定性差、储存运输条件严苛、不可重复使用等缺点，限制了其在各个领域的广泛应用。酶固定化技术，在保持催化活性的同时，将游离酶固定在载体上，可以显著提高酶的稳定性。此外，固定化酶可以回收利用。因此，酶固定化在过去的几十年中得到了广泛的发展，这对酶在工业过程中应用的可行性产生了重大的经济和科学影响。传统的固定化技术可分为吸附法、包埋法、交联法和共价结合法四大类。

与其他方法相比，共价结合法将活性氨基酸残基共价连接到载体表面，能够提供稳定的固定化。这种方法需要载体上大量的可修饰基团与酶分子发生化学偶联，使得共价结合固定化的酶几乎不泄漏。因此，共价结合法制备的固定化酶具有很强的稳定性。但相关技术中，有在酶表面包覆明胶得到了碳材料固定化酶，通过光固化水凝胶制备固定化酶，通过交联剂对氨基树脂载体进行修饰从而使酶网状交联而固定化，但以上方法由于载体基团对酶活性中心的影响以及酶与载体之间的相互作用，会显著降低固定化酶的催化活性，而且这些方法对酶的种类选择都有局限性。

发明内容

为解决相关技术中出现的问题，本发明提供了一种改性聚合物微球、制备方法以及将其用在选择性固定化酶的方法，通过自稳定沉淀聚合方法一步制备了聚合物微球，改性后通过简单的振荡吸附即可选择性固定化His标签酶，对酶活不产生影响，操作简单，经济环保。本发明的方法对酶的纯度要求不高，可选择的酶的种类范围广，制备得到的固定化酶结合牢靠，可进行多次酶催化反应。

本发明提供的一个技术方案是一种改性聚合物微球的制备方法，包括：

将苯乙烯与表面带有吸电子基团的单体发生自稳定沉淀聚合反应，经过洗涤、离心、干燥得到未改性聚合物微球；

将所述未改性聚合物微球与螯合配体超声分散于超干溶剂中，氮气保护下反应8-12h；

加入过渡金属盐，所述的吸电子基团与过渡金属离子的摩尔比为1∶(0.5～6)，室温下搅拌反应4-6h，透析24-48h后干燥得到改性聚合物微球。

在本发明的可选实施案例中，所述螯合配体与所述表面带有吸电子基团的单体的摩尔比为1∶(1.1～2)，优选1∶(1.2～1.5)。

在本发明的可选实施案例中，所述螯合配体具有以下结构：

其中，R₁，R₂，R₃各自独立地为氢原子，羧基，吡啶、-CH₂COOH、PO₄^3-。

作为一种或多种优选实施方案，所述螯合配体可以是二甲基吡啶胺、亚胺基二乙酸、次胺基三乙酸、乙二胺四乙酸中的至少一种。

在本发明的可选实施案例中，所述过渡金属盐为二水合氯化铜、无水硫酸铜、五水合硫酸铜、三水合硝酸铜、氯化锌、七水合硫酸锌、六水合氯化镍、六水合硫酸镍、六水合氯化钴、七水合硫酸钴。