[发明专利]使用蛋白酶控制限制酶活性

说明书

蛋白酶是水解蛋白质酶、消除其活性的酶。本发明利用包括蛋白酶K、内切蛋白酶LysC和/或胰蛋白酶的蛋白酶的水解活性来控制限制酶的活性和/或消除或减少不需要的DNA或RNA片段的产生(称为星号活性)。

背景技术

限制酶、也称为限制性核酸内切酶是水解酯键的水解酶的一个子类，作为 DNA或RNA核酸酶并切割特定的DNA或RNA序列。当进行酶消化反应时，应优化所有涉及酶的活性，以精确获得预期的产品或结果。大多数限制酶随着时间连续催化底物(DNA或RNA)，从而连续积累所需的DNA或RNA片段，偶尔也会积累不需要的副产物。

虽然通常通过特定的缓冲液和反应时间条件来尝试优化限制性核酸内切酶的酶反应，但有时也会存在不期望的反应和相关问题，特别是当酶在其主要活性之外还表现出非靶向活性时。优化的限制性核酸内切酶活性通常在设定时间内消化指定量的底物。然而，一些限制性核酸内切酶产生副反应和不需要的DNA 或RNA切割，具有累积的活性，尤其是在反应中酶过量时，其中反应在特定缓冲条件下持续很长时间，或者存在高甘油。在同源限制性位点以外的位点处的这种切割被称为星号活性。

控制酶的浓度或总反应时间、例如反应完成后通过热失活或其他纯化方法终止反应是限制酶总活性从而降低星号活性的常用方法。其他控制反应的方法可能更可取，特别是在需要精细控制以达到更高的分析可靠性时。

发明内容

蛋白酶是水解蛋白质酶、消除其活性的酶。本发明利用蛋白酶的水解活性来控制限制酶的活性并消除或减少不需要的DNA或RNA片段的产生。

在本发明中，蛋白酶最初包含在限制性核酸内切酶反应混合物中或在某些点添加到其中，使得限制酶在它们的DNA/RNA消化反应过程中被蛋白酶灭活。以这种方式，总酶活性不仅受缓冲液和反应时间的控制，还受底物、限制性核酸内切酶和蛋白酶的相对量(有时包括蛋白酶添加时间)的控制，以便进一步限制过度消化和星号活性。蛋白酶抑制剂可任选地用于在反应的所需点停止或抑制蛋白酶活性。

本发明在以下附图和描述中、包括在实施例中进一步描述，

附图说明

图1：根据DNA序列及酶识别和切割特异性，BamHI、EcoRI和NcoI对λDNA 的理论完整图案。该图案可以与图3-8中所示的任何条带对齐，以表示切割和星号活性的完成。

图2：模块A：预测的内在限制性核酸内切酶活性。实线：不含蛋白酶的限制性核酸内切酶活性；虚线，具有蛋白酶的限制性核酸内切酶。模块B：总限制性核酸内切酶活性。实线：不含蛋白酶的总限制酶活性；虚线，具有蛋白酶的总限制酶活性。

图3：在缓冲液A1和A1S2中EcoRI对λDNA的酶活性。模块A：在缓冲液A1中1小时，模块B：在缓冲液A1S2中1小时，模块C：在缓冲液A1中 20小时，模块D：在缓冲液A1S2中20小时。下降三角形(顶部)代表限制性核酸内切酶的2倍连续稀释。

图4：在缓冲液A2和A2S2中EcoRI对λDNA的酶活性。模块A：在缓冲液A2中1小时，模块B：在缓冲液A2S2中1小时，模块C：在缓冲液A2中 20小时，模块D：在缓冲液A2S2中20小时。下降三角形(顶部)代表限制性核酸内切酶的2倍连续稀释。

图5：在缓冲液A3和A3S2中EcoRI对λDNA的酶活性。模块A：在缓冲液A3中1小时，模块B：在缓冲液A3S2中1小时，模块C：在缓冲液A3中 20小时，模块D：在缓冲液A3S2中20小时。下降三角形(顶部)代表限制性核酸内切酶的2倍连续稀释。

图6：在缓冲液A3和A3S2中BamHI对λDNA的酶活性。模块A：在缓冲液A3中1小时，模块B：在缓冲液A3S2中1小时，模块C：在缓冲液A3中 20小时，模块D：在缓冲液A3S2中20小时。下降三角形(顶部)代表限制性核酸内切酶的2倍连续稀释。