[发明专利]使用蛋白酶控制限制酶活性

权利要求书

1.一种抑制或防止限制性核酸内切酶的星号活性的方法，其包括：

使用包含所述限制性核酸内切酶、缓冲液和寡聚体的反应混合物消化寡聚体；

在所述反应混合物中包括或添加蛋白酶K、内切蛋白酶LysC和/或胰蛋白酶，以抑制或防止所述限制性核酸内切酶的星号活性，以及

通过添加包含加载染料的终止溶液终止所述消化。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述寡聚体是λDNA。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述缓冲液为20mM Tris-HCl、pH 7.4、40mMKoAc、10mM MgCl₂、0.1mM CaCl₂；或20mM Tris-HCl、pH 7.5、40mM NaCl、10mM MgCl₂、0.1mMCaCl₂。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述终止溶液包含2.5％-400、11mM EDTA(pH 8.0)、3.3mM Tris-HCl、0.017％SDS、0.015％溴酚蓝。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，添加6x所述终止溶液。

6.一种确定限制性核酸内切酶和蛋白酶的抑制或防止所述限制性核酸内切酶的星号活性的最佳相对浓度的方法，其包括：

(i)将所述限制性核酸内切酶、所述蛋白酶、缓冲液和寡聚体组合，以达到各自的起始浓度；

(ii)在反应时间后确定所述限制性核酸内切酶的所述星号活性，并且如果有的话，稀释所述反应混合物并在所述反应时间内重复所述反应；

(iii)重复步骤(ii)直到没有星号活性；以及

(iv)确定所述限制性核酸内切酶和蛋白酶的在星号活性停止时的浓度。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述蛋白酶与所述限制性核酸内切酶同时组合。

8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述限制性核酸内切酶是EcoRI、NcoI或BamHI。

9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述蛋白酶是蛋白酶K、内蛋白酶LysC或胰蛋白酶。

10.根据权利要求6所述的方法，其中，所述寡聚体是λDNA。

11.根据权利要求6所述的方法，其中，所述缓冲液为20mM Tris-HCl、pH 7.4、40mMKoAc、10mM MgCl₂、0.1mM CaCl₂；或20mM Tris-HCl、pH 7.5、40mM NaCl、10mM MgCl₂、0.1mMCaCl₂；以及20mM Tris-HCl、pH 8.0、10mM MgCl₂、0.1mM CaCl₂。

12.根据权利要求6所述的方法，其中，所述限制性内切核酸酶活性通过添加终止溶液来终止。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述缓冲液为20mM Tris-HCl、pH 8.0、10mMMgCl₂、0.1mM CaCl₂。