[发明专利]一种劳森氏菌免疫胶体检测试纸条的组装方法

权利要求书

1.一种劳森氏菌免疫胶体检测试纸条的组装方法，其特征在于：劳森氏菌免疫胶体金检测试纸条由兔抗劳森氏菌多克隆抗体、羊抗鼠IgG、鼠抗劳森氏菌LscN单克隆抗体和NC膜制备；

用鼠抗劳森氏菌LscN单克隆抗体制备金标探针，用兔抗劳森氏菌多克隆抗体作为检测线，用羊抗鼠IgG作为质控线，用PBS、1％BSA、0.2％Tween-20、0.05mol/LNaCl溶液封闭NC膜，水洗并干燥；将以上组件组装成劳森氏菌免疫胶体金检测试纸条；

兔抗劳森氏菌多克隆抗体的制备和纯化：

S1、提取劳森氏菌的菌液，并对提取的菌液进行灭活处理；

S2、选取健康的兔子样本；

S3、将灭活好的菌液稀释至2×109CFU/mL，稀释后的菌液进行乳化，将乳化后的菌液多点皮下注射接种兔子，每隔2周用同样处理、同样浓度、同样剂量的菌液乳化后免疫；

S4、第三次免疫后7天，在兔子的耳静脉采血，采用ELISA方法检测血清抗体效价，达到要求后，再兔子的心脏采血，收集血清，分装后于﹣20℃冷冻保存；

羊抗鼠IgG的制备和纯化：

S1、选取健康的山羊和健康的小白鼠；

S2、经小白鼠的颈总动脉放血，取得鼠血清，然后用1次50％饱和硫酸铵和2次33％饱和硫酸铵沉淀盐析，得到粗提的鼠血清球蛋白，将粗提的鼠血清球蛋白经葡聚糖凝胶进行凝胶过滤，得到纯化的鼠血清IgG；

S3、按照50g/L加入纯化的鼠血清IgG，10g/L加入卡介苗，在两支5ml的注射器内进行对抽，制得抗原混合物；

S4、在山羊的腿部肌肉注射2ml的抗原混合物，腿部分两点注射，背部皮下四点注射1ml，进行一次免疫，每隔2周用同样处理、同样浓度、同样剂量的抗原混合物注射后免疫；

S5、第四次免疫后7天，对山羊进行抽血，做琼脂糖双扩散实验，测试结果符合后，在山羊的颈动脉处抽血，收集血清抗体，分装后于﹣20℃冷冻保存。

2.根据权利要求1所述的一种劳森氏菌免疫胶体检测试纸条的组装方法，其特征在于：劳森氏菌LscN蛋白的原核表达和纯化：

设计lscN全长引物，以劳森氏菌基因组为模板，PCR扩增全长，连接T载体，转化DH5α，提取质粒，测序，检测正确后连接pcold载体，构建原核表达载体，转化BL21，选取阳性克隆，小量表达，SDS-PAGE和western blot检测，大量表达，切GST标签。

3.根据权利要求1所述的一种劳森氏菌免疫胶体检测试纸条的组装方法，其特征在于：鼠抗劳森氏菌LscN单克隆抗体制备和纯化：

S1、提取劳森氏菌的菌液，并对提取的菌液进行灭活处理；

S2、选取健康的小白鼠；

S3、用灭活劳森氏菌菌液乳化后多次免疫Balb/c小鼠，使血清效价在108以上；

S4、处死达到要求的Balb/c小鼠，无菌取脾，制备脾细胞悬液，并与事先复苏至对数生长期的SP2/0细胞按10:1混合，加入50％的PEG，静止30s后，洗涤，然后缓慢滴加20mL含HT的20％FCS1640培养基，静置30min后，轻轻吹起细胞，加入到含滋养层细胞的96孔板中，置于37℃5％CO2培养箱中培养融合细胞；

S5、待融合细胞生长到预定程度，以纯化的LscN蛋白为包被抗原，用ELISA方法检测细胞培养上清，筛选杂交瘤细胞并采用有限稀释法克隆杂交瘤细胞，分别培养出第一代克隆株、第二代克隆株和第三代克隆株；对于第二代克隆株和第三代克隆株中的阳性克隆进行扩大培养，并用液氮冻存；

S6、对阳性克隆进行杂交瘤细胞染色体鉴定，选取分泌抗体稳定性大的细胞株，腹腔注射到健康Balb/c小鼠体内，制备腹水，进行单克隆抗体亚型的鉴定；

S7、然后分别用辛酸-硫酸铵法和亲合层析法纯化单克隆抗体；

S8、对腹水中蛋白质、抗体含量，单克隆抗体的纯度、分子量，单克隆抗体的特异性、亲和力进行测定。

4.根据权利要求1所述的一种劳森氏菌免疫胶体检测试纸条的组装方法，其特征在于：劳森氏菌免疫胶体金检测试纸条效果检测：

选取增生性肠炎阳性猪肠，应用试纸条的特异性试验检测、敏感性试验检测和稳定性试验检测，并与PCR检测方法比较，评定免疫胶体金试纸条的准确率；最后对试纸条进行临床试验。