[发明专利]运用沼泽红假单胞菌表达壳聚糖酶的方法、壳聚糖酶、重组质粒、重组菌、发酵菌剂及应用

说明书

本发明公开了一种运用沼泽红假单胞菌表达壳聚糖酶的方法、壳聚糖酶、重组质粒、重组菌、发酵菌剂及应用，将编码枯草芽孢杆菌的壳聚糖酶基因序列构建重组质粒，重组质粒通过大肠杆菌接触转化至沼泽红假单胞菌菌体内，得到沼泽红假单胞菌重组菌，将沼泽红假单胞菌重组菌发酵培养，获得壳聚糖酶。本发明的运用沼泽红假单胞菌表达壳聚糖酶的方法，通过构建含有壳聚糖酶基因的重组质粒，并在沼泽红假单胞菌中自然表达，不需要壳聚糖诱导，不影响重组菌的生长，表达的胞外壳聚糖酶能够持续水解壳聚糖形成壳寡糖，改善壳聚糖的溶解性，含有壳寡糖的发酵菌剂能够直接使用。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别地，涉及一种运用沼泽红假单胞菌表达壳聚糖酶的方法。此外，本发明还涉及一种壳聚糖酶、重组质粒、重组菌、发酵菌剂及应用。

背景技术

壳聚糖(chitosan)是由甲壳素脱除部分N-脱乙酰基的产物，具有诸多特点，广泛应用于农业领域。但是高聚合度的壳聚糖分子量大，水溶性差，不易被植物吸收，具有极强的絮凝作用，严重限制了壳聚糖的直接使用以及与其他生物制剂、微生物制剂的复配使用。运用壳聚糖酶(Chitosanase，EC 3.2.1.132)水解壳聚糖，能使壳聚糖聚合度降低，产生壳寡糖，极大的改善了壳聚糖在使用中的诸多弊端。

目前壳聚糖酶基因主要来自细菌和真菌类微生物，但是微生物中的壳聚糖酶基因并不能自然表达，需要通过向培养基中添加壳聚糖来诱导基因表达。然而壳聚糖不溶于水，需通过醋酸甚至盐酸溶解，壳聚糖胶体溶液添加到培养基后严重影响培养基的pH进而影响微生物生长。其次，壳聚糖胶体溶液稳定性非常差，添加到培养基后极易析出，对微生物也具有极强的絮凝作用，进一步限制微生物的生长，致使壳聚糖酶不表达或及少量表达。

发明内容

本发明提供了一种运用沼泽红假单胞菌表达壳聚糖酶的方法、壳聚糖酶、重组质粒、重组菌、发酵菌剂及应用，以解决微生物中的壳聚糖酶基因不能自然表达，通过壳聚糖诱导表达又影响微生物生长的技术问题。

本发明采用的技术方案如下：

一种运用沼泽红假单胞菌表达壳聚糖酶的方法，将编码枯草芽孢杆菌的壳聚糖酶基因序列构建重组质粒，重组质粒通过大肠杆菌接触转化至沼泽红假单胞菌菌体内，得到沼泽红假单胞菌重组菌，将沼泽红假单胞菌重组菌发酵培养，获得壳聚糖酶。

进一步地，编码枯草芽孢杆菌的壳聚糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。运用壳聚糖酶基因保守序列的通用引物csnS_F(SEQ ID No.3)和csnS_R(SEQ ID No.4)，通过高保真PCR技术以枯草芽孢杆菌CS2(来自土壤分离纯化)基因组DNA为模板，使用引物csnS_F(SEQ ID No.3)和csnS_R(SEQ ID No.4)克隆了一种来源于枯草芽孢杆菌的壳聚糖酶基因，其全长为834bp。NCBI登录号为：OK272498。沼泽红假单胞菌HL-1(来自海水分离纯化)。

进一步地，沼泽红假单胞菌重组菌发酵培养包括：将沼泽红假单胞菌重组菌于含有50μg/mL的硫酸卡拉霉素的发酵培养基中，25～30℃，5～25W(色温3000～6500K)的日光灯，厌氧光照培养7～10天，获得壳聚糖酶。优选地，28℃，14W(色温6500K)的日光灯，厌氧光照培养7天。发酵培养基包括：NaAC 0.5g/L～2g/L，草酸铵0.5g/L～2g/L，yeastextract0.5g/L～4g/L，FeSO₄·7H₂O 0.0005g/L～0.05g/L，Na₂MoO₄ 0.01g/L～0.05g/L。其中yeast extract为酵母粉。优选地，发酵培养基包括：NaAC 1g/L，草酸铵0.5g/L，yeastextract 2g/L，FeSO₄·7H₂O0.0025g/L，Na₂MoO₄ 0.015g/L。