[发明专利]一种用于富集尿液中甲基化腺嘌呤核苷的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种用于富集尿液中甲基化腺嘌呤核苷的方法及其应用。该方法采用磁性石墨烯材料对人体尿液样本中的多种甲基化腺嘌呤核苷进行富集，再使用液相色谱串联质谱进行分析。本发明的优点是实现了尿液等复杂生物样本中N⁶‑甲基‑2'‑脱氧腺苷(m⁶dA)、N⁶‑甲基腺苷(m⁶A)、2'‑O‑甲基腺苷(A_m)、N⁶,2'‑O‑二甲基腺苷(m⁶A_m)和N⁶,N⁶‑二甲基腺苷(m⁶₂A)同时富集，本发明方法可在分析化学、临床医学、预防医学以及代谢组学领域中应用，通过磁铁同时富集检测样品液中多种甲基化腺嘌呤核苷，再进行液相色谱质谱检测，从而提高检测准确率。具有很好的推广价值。

技术领域

本发明属于分析化学、医学和纳米材料技术领域。涉及一种用于富集尿液中甲基化腺嘌呤核苷的方法，是通过磁性石墨烯材料对尿液中甲基化腺嘌呤核苷的富集，对尿液的样品前处理中，从而能实现尿液中多种甲基化腺嘌呤核苷的同时富集，以利于后续更好的液相色谱质谱检测。

背景技术

N⁶-甲基-2'-脱氧腺苷(m⁶dA)常见于原核生物的基因组中，在调节细菌的许多生物过程中起着至关重要的作用。近年来，m⁶dA被发现存在于人类基因组中，并在基因表达、染色质构型、肿瘤发生中起重要的调节作用。研究表明m⁶dA在人胶质母细胞瘤和食管鳞状细胞癌中升高。相反，也有研究报告称在原发性胃癌、肝癌和肺癌中，m⁶dA水平相对于正常组织下降。N⁶-甲基腺苷(m⁶A)、2'-O-甲基腺苷(A_m)、N⁶,2'-O-二甲基腺苷(m⁶A_m)和N⁶,N⁶-二甲基腺苷(m⁶₂A)，是重要的RNA甲基化修饰，这些修饰的核苷可以影响mRNA的稳定性和翻译效率，在细胞分化、胚胎发育以及肿瘤发生发展中起着至关重要的调控作用。研究表明m⁶A等甲基化腺嘌呤修饰核苷在不同肿瘤类型中呈现出不同的表达水平。因此，对m⁶dA,m⁶A,A_m,m⁶A_m和m⁶₂A进行定性定量分析在代谢组学、生物化学、生命科学以及临床医学等研究领域中有着非常重要的作用。

目前，甲基化修饰核苷的分析仍然在不断的拓展和完善中，我们应用靶向代谢组学的方法，以标准品作为对照，应用亲水相互作用色谱串联质谱技术对尿液样本中的甲基化腺嘌呤核苷进行绝对定量，用来鉴定其作为疾病的早期诊断的标志物。但是，在实际的尿液标本检测中，这些修饰核苷的含量极低，使得对这些化合物进行同时定量分析具有极大的困难与挑战。因此，选择性富集是提高检测灵敏度一种有效的策略。目前已报道的富集核苷的方法主要运用基于硼亲和吸附的材料，然而该方法只能实现具有邻位二羟基的核糖核苷富集，无法实现对脱氧核糖核苷以及2'-O修饰的核糖核苷的富集。

发明内容

针对现有技术存在的弊端，本发明的目的是提供一种用于富集尿液中甲基化腺嘌呤核苷的方法，是利用磁性石墨烯材料来作为富集材料，对尿液样品进行前处理，同时富集多种目标甲基化腺嘌呤核苷，获得最佳的目标物提取效率，从而实现其定性定量质谱分析。

为实现上述发明目的，本发明方法通过以下步骤实现：

(1)尿液样本在室温下解冻，在4℃下以13000rpm转速离心15分钟。取上清液于1.5mL离心管中，并加水稀释；取离心后尿液上清液的体积为100μL，加入水的体积为300μL；