[发明专利]一种用于富集尿液中甲基化腺嘌呤核苷的方法及其应用

权利要求书

1.一种用于富集尿液中甲基化腺嘌呤核苷的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）尿液样本在室温下解冻，在4℃下以13000 rpm转速离心15分钟，取上清液于1.5 mL离心管中，并加水稀释；

（2）称取0.1-4 mg特殊富集材料于1.5 mL离心管中，并依次用甲醇、水清洗，随后将稀释后的尿液加入离心管中，超声0.5-30分钟后静置1-20分钟，所述特殊富集材料为磁性石墨烯；

（3）将磁铁放置于1.5 mL离心管外部，弃去上清液，加水进行清洗，弃去上清液；

（4）加入含有乙酸的甲醇溶液洗脱，涡旋后将磁铁放置于离心管外侧，用磁铁将特殊富集材料与洗脱液分离，收集洗脱液，重复解吸程序四次，合并洗脱液，随后真空离心干燥；

（5）用乙腈/水复溶后，使用亲水相互作用色谱串联质谱分析；

（6）配制不同浓度的混合标准溶液，并加入同位素标记的内标化合物，运用HILIC-MS/MS进行分析，得到线性回归方程，对尿液样本进行测定，测得分析物与同位素内标的峰面积比值，代入线性方程，计算得到样本中分析物的含量；

其中HILIC-MS/MS检测条件为：流动相：A相由10 mM乙酸铵、0.2%乙酸及水组成；B相由0.05 mM苹果酸、2 mM乙酸铵、0.2%乙酸及乙腈组成；采用6% A、94% B的等度洗脱程序，流速为0.25 mL/min；使用的色谱柱为Waters公司BEH HILIC柱，2.1 × 100 mm，1.7 μm；进样为5 μL；

所述的甲基化腺嘌呤核苷分别为：N⁶-甲基-2'-脱氧腺苷、N⁶-甲基腺苷、2'-O-甲基腺苷、N⁶, 2'-O-二甲基腺苷和N⁶, N⁶-二甲基腺苷。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中取离心后尿液上清液的体积为100 μL，加入水的体积为300 μL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中特殊富集材料的用量选为2mg，清洗用的甲醇和水的体积均为1 mL，超声时间选为5分钟，静置时间选为1分钟。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中清洗用水的体积为1 mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中洗脱溶液为含有0.1%乙酸的甲醇溶液，每次洗脱所用的体积为0.6 mL，洗脱总次数为4次，涡旋时间为5秒。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中复溶所用的溶剂为100 μL乙腈/水，9:1, v/v，所使用的色谱柱为BEH HILIC柱 2.1 × 100 mm, 1.7 μm。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（6）中混合标准溶液为N⁶-甲基-2'-脱氧腺苷、N⁶-甲基腺苷、2'-O-甲基腺苷、N⁶, 2'-O-二甲基腺苷和N⁶, N⁶-二甲基腺苷，使用的稳定同位素标记的内标化合物为[D₃]m⁶dA、[D₃]m⁶A、 [¹³C₅]A_m、[D₃]m⁶A_m和[¹³C₅]m⁶₂A。