[发明专利]炭耦合复合型菌剂及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种炭耦合复合型菌剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、将可炭化天然材料进行处理，得到炭基材料，作为后续耦合材料之一；

S2、采集典型污染点位土壤的土壤样品制得土壤悬浮液，使用扩散室原位培养法对土壤中的微生物进行分离培养，得到含有目标菌株的土壤微生物富集液；

S3、对富集液进行多个周期的菌种筛选驯化，得到能在重金属胁迫下对多环芳烃有降解能力的菌种；

S4、对上述有降解能力的菌种使用平板涂布法进行分离纯化，得到降解菌的纯菌落；

S5、重复步骤S4，分别收集至少3个菌种纯化后的菌体，用LB液体培养基富集培养至OD600=1.0～1.2，收集菌液冷冻保存；

S6、将活化后的多种菌液以一定的比例进行混合，得到复合菌种子液，作为耦合材料之一；

S7、将复合菌种子液与炭基材料按比例混合培养一段时间后，进行固定化处理，得到复合型菌剂。

2. 如权利要求1所述的炭耦合复合型菌剂的制备方法，其特征在于：步骤S1中所述的可炭化天然材料包括玉米秸秆、螃蟹壳、茄子秆、竹叶、木棉纤维和鹿粪中的一种或多种。

3.如权利要求1所述的炭耦合复合型菌剂的制备方法，其特征在于：步骤S1中通过以下步骤将可炭化天然材料进行处理：

S11、将可炭化天然材料洗净除杂、干燥并粉碎为粉末；

S12、经过300～700 ℃隔氧闷烧高温慢裂解1～3小时；

S13、在保护气体和冷凝循环水保护下冷却至室温，依次经过研磨过筛，盐酸浸泡活化，蒸馏水洗涤和烘干后得到炭基材料。

4.如权利要求1所述的炭耦合复合型菌剂的制备方法，其特征在于：所述典型污染点位土壤是指农药污染农田、石油烃污染土壤、红树林根系土壤、制造工厂附近土壤或干涸泥床土壤。

5.如权利要求1所述的炭耦合复合型菌剂的制备方法，其特征在于：所述的土壤悬浮液通过以下方法制得：

称取10g土壤样品，加入90ml灭菌超纯水，混匀后进行超声处理，然后静置30～60min，获取含有微生物的上清液；

超声处理条件为超声波振幅40μm，超声时间为10s，间隔5s，进行2次。

6.如权利要求1所述的炭耦合复合型菌剂的制备方法，其特征在于：步骤S2中，扩散室原位培养法的过程如下：

S100、配制原位培养基：取土壤采样点附近的水1L，自然pH值，加入1%(wt/vol)琼脂粉混匀，高温灭菌后降温至45℃，得到温琼脂；

S200、接种和组装扩散室：将已灭菌的0.03μｍ孔径聚碳酸酯膜用密封胶与已灭菌的不锈钢垫圈的底面贴好，向中空内环引入土壤悬浮液和温琼脂的混合物，然后将0.03μｍ孔径聚碳酸酯膜和不锈钢垫圈顶面用胶水密封，形成一个密封室；

S300、将扩散室埋于原始采样位置或模拟自然环境中进行孵育，深度为5～10cm；孵育1周后，将原位培养装置取回、清洁后，将原位培养基转移到无菌1.5ml的EP管中，加入无菌水，将原位培养基捣碎并充分与无菌水混匀，离心得到菌悬液。

7.如权利要求1所述的炭耦合复合型菌剂的制备方法，其特征在于：步骤S3中，菌种驯化的过程如下：

吸取步骤S2中的菌悬液涂布于新扩散室的驯化培养基中，使用扩散室在原位培养四个驯化周期，每周期将菌悬液转接到新构建的 扩散室中，设置四个不同浓度梯度的驯化培养基，在原位培养基中添加一定浓度的有机污染物和重金属进行筛选和驯化能在胁迫下对目标污染物有降解能力的菌种。

8.如权利要求1所述的炭耦合复合型菌剂的制备方法，其特征在于：步骤S7中，复合菌种子液与炭基材料按1:10～30（w/v）的比例混合培养。

9.如权利要求1所述的炭耦合复合型菌剂的制备方法，其特征在于：步骤S7中，所述的固定化处理为将复合菌液与炭基材料按照1:10～30（w/v）的比例混合培养12～24h，完成吸附耦合后，在无菌环境下过筛网，保留固体材料并干燥。