[发明专利]一种提高乳酰-N-岩藻五糖产量的基因工程菌及其生产方法

说明书

本发明公开了一种提高乳酰‑N‑岩藻五糖产量的基因工程菌及其生产方法，属于生物技术和食品发酵工程领域。本发明通过外源基因lgtA，wbgO和futC的表达和大肠杆菌内源基因galE，galT，galK，manB，manC，gmd和wcaG的过表达，从而构建出乳酰‑N‑岩藻五糖的从头合成路径，以及敲除大肠杆菌宿主乳酰‑N‑岩藻五糖合成途径中旁支路径的lacZ和wcaJ表达，从而提高乳酰‑N‑岩藻五糖产量。在摇瓶发酵中，乳酰‑N‑岩藻五糖的产量达到1.99g/L，在3L发酵罐中，乳酰‑N‑岩藻五糖的产量达到16.8g/L，成功打造更高效的生产菌株，为乳酰‑N‑岩藻五糖的工业化生产奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种提高乳酰-N-岩藻五糖产量的基因工程菌及其生产方法，属于生物技术和食品发酵工程领域。

背景技术

人乳寡糖(human milk oligosaccharides，HMOs)是存在于人乳中仅次于乳糖和脂质的第三大固体成分，大量体外研究表明，HMOs具有良好的保健效果，包括拮抗微生物活性、抵抗病毒侵害和预防坏死性小肠结肠炎等功效。对婴儿消化系统的早期发育，及出生后免疫系统的完善和体内生态平衡的建立发挥着不可替代的作用。乳酰-N-岩藻五糖(LNFPI)是人乳寡糖中的一种重要寡糖，它是通过α1,2-岩藻糖基转移酶对乳酰-N-四糖(LNT)进行岩藻糖基化生成，在作为益生元、免疫调节、抗粘连、抗菌活性和肠道细胞反应调节方面具有重要作用。鉴于乳酰-N-岩藻五糖的重要生物功能和生理活性，为阐明其作用机制，需要制备大量结构均一的该类化合物，然而从天然产物中分离提取所得到的量很少，远不及研究的需要，因此通过人工合成的方法获得该类化合物就成为最佳选择。

目前报道的乳酰-N-岩藻五糖的合成方法主要包括三种，分别是化学合成、酶法合成和发酵法合成。乳酰-N-岩藻五糖的化学合成需要多个繁琐的保护和脱保护步骤。酶促合成方案是已知的，但供体底物核苷酸糖相对昂贵且产量低，使得合成的乳酰-N-岩藻五糖无法以合理的价格进行进一步研究。由于不存在自然状态下合成乳酰-N-岩藻五糖的微生物，所以从廉价碳源(葡萄糖、甘油、乳糖)生产乳酰-N-岩藻五糖的重组细菌的全细胞生物合成方法越来越受到青睐。

最近，目前Florian等人利用补加岩藻糖的方法在大肠杆菌细胞内发酵合成乳酰-N-岩藻五糖，产量达到271.6mg/L(Florian等人，2015)，但是该方法补加岩藻糖作为二磷酸尿苷岩藻糖(UDP-岩藻糖)的供给，导致生产成本升高，且最终产量很低，因此，寻求廉价高产的乳酰-N-岩藻五糖从头合成途径来解决目前微生物生产的瓶颈，打造更高效的生产菌株是迫切需要解决的问题。

发明内容

[技术问题]

现有技术中生产乳酰-N-岩藻五糖的方法，成本高昂且最终产量很低，无法提供成本低廉且高效的乳酰-N-岩藻五糖的微生物合成法。

[技术方案]

本发明为了解决现有微生物方法合成的乳酰-N-岩藻五糖产量较低的问题，提供了一种产乳酰-N-岩藻五糖的基因工程菌及其构建方法。

本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ，并过表达磷酸甘露糖变位酶基因manB，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC，GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd，GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG和α-1,2岩藻糖基转移酶基因futC。

在一种实施方式中，所述基因工程菌还过表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因galE、半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶基因galT，半乳糖激酶基因galK，过表达β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因lgtA和/或β-1,3-半乳糖基转移酶基因wbgO。