[发明专利]一种高产蛋白质谷氨酰胺酶的枯草芽孢杆菌突变菌株

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体提供了一株高产蛋白质谷氨酰胺酶的枯草芽孢杆菌突变菌及其应用。申请人将来源于解朊金黄杆菌（Chryseobacterium proteolyticum）的蛋白质谷氨酰胺酶基因，在枯草芽孢杆菌宿主中过表达，构建得到重组表达菌株；然后以该菌株为出发菌进行紫外诱变，筛选获得一株能大幅提高蛋白质谷氨酰胺酶表达量的突变菌，同时该突变菌的耐盐性也得到显著提升，其保藏编号为CCTCC NO：M2021407。所述突变菌可以广泛应用于蛋白质谷氨酰胺酶的生产，有利于降低该酶的生产成本。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体内容涉及一种高产蛋白质谷氨酰胺酶的枯草芽孢杆菌突变菌株及其应用。

背景技术

蛋白质的脱酰胺作用被公认为是提高植物蛋白溶解度的最有前景的途径，己经成为国内外研究的热点。目前，脱酰胺的方法主要包括非酶法、酶法脱酰胺及混合法脱酰胺3种。其中，非酶脱酰胺主要为碱法脱酰胺和酸调脱酰胺。利用碱法进行蛋白质脱酰胺作用，不可避免地会破坏蛋白质中的半胱氨酸，进而生成对生物体具有一定毒害作用的赖氨酸和丙氨酸；酸法脱酰胺即酸提供Ｈ^＋破坏酰胺键，脱去氨。非酶法脱酰胺会给蛋白质带来不同程度的结构破坏，引起一些不良的副反应，且不具备专一性。酶法脱酰胺由于反应条件不剧烈，专一性高，同时不会带来多种不良副反应，引起更多的关注。

蛋白质谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.44，Protein-glutaminase，简称PG）可以水解蛋白质侧链的谷氨酰胺并生成蛋白质L-谷氨酸盐和氨，是一种新型的蛋白质脱酰胺酶，且无蛋白酶活性和谷氨酰胺转氨酶活性。2000年，日本人Yamaguchi S.等发表文献声明从日本筑波的土壤中分离得到一株具有对CBZ-Gln-Gly和酪蛋白脱酰胺活性和蛋白酶活性的菌株，并鉴定其为金黄杆菌属新种，将其命名为  Chryseobacterium proteolyticum（解朊金黄杆菌），以菌株9670T为模式菌株，并从其培养上清中纯化出具有工业应用潜力的PG。PG酶能够直接催化大分子蛋白质脱酰胺，而不需要先对蛋白质进行水解，脱酰胺过程并不会引起蛋白质结构的不良变化；且特异性高，只作用于蛋白质侧链的谷氨酰胺，而不能使天冬酰胺脱酰胺。因此，蛋白质谷氨酰胺酶被称为最具有潜力的蛋白质改性工具。

野生的解朊金黄杆菌产酶活低，不能满足工业生产的要求。传统诱变和原生质体融合均有一定的不确定性，不能定向地提高酶活，且没有可以直接应用于解朊金黄杆菌为宿主菌的分子生物学工具。所以，异源表达蛋白质谷氨酰胺酶成为提高其产量的最佳手段，也是目前该领域的研究热点。

发明内容

 本发明为解决现有技术问题，提供了一种高产蛋白质谷氨酰胺酶的枯草芽孢杆菌突变菌株及其应用。申请人将来源于解朊金黄杆菌（ Chryseobacterium proteolyticum）的蛋白质谷氨酰胺酶基因，在枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）宿主中过表达，构建得到重组表达菌株；然后以该菌株为出发菌进行紫外诱变，筛选获得一株能大幅提高蛋白质谷氨酰胺酶表达量和耐盐性的突变菌。该突变菌可以广泛应用于蛋白质谷氨酰胺酶的生产，有利于降低该酶的生产成本。

本发明一方面提供了一种枯草芽孢杆菌工程菌株，其携带有表达蛋白质谷氨酰胺酶的重组质粒。

所述蛋白质谷氨酰胺酶的氨基酸基因序列为SEQ ID NO：1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2。