[发明专利]一种ASP联合hAD-MSCs治疗POI的实验方法

说明书

本发明涉及一种ASP联合hAD‑MSCs治疗POI的实验方法，包括以下步骤：ASP含药血清的制备；不同浓度ASP含药血清加入培养基中培养hAD‑MSCs；hAD‑MSCs移植；5)实验分组；电镜观察各级卵泡和子宫内膜超微结构变化；免疫组化测定颗粒细胞表面标志Fshr和卵母细胞表面标志DDX4表达；Elisa法测定卵巢和子宫组织抗氧化酶与氧化产物ROS、SOD、等分泌情况；13)Western‑blot测定和磷酸化水平变化情况；Tunel染色测定卵泡颗粒细胞和卵母细胞的凋亡情况；免疫荧光双标记测定卵巢组织FOXO3a表达；16)合笼实验。本发明优点在于：采用当归多糖联合hAD‑MSCs提高干细胞的增殖，可以改善放射性POI的微环境，促进干细胞迁移归巢及局部的存活率，提高干细胞的对放射性POI治疗效果，具有很好的推广前景。

技术领域

本发明涉及一种ASP联合hAD-MSCs治疗POI的实验方法。

背景技术

放疗(Radiotherapy RT)所致卵巢功能不全(premature ovarian insufficiencyPOI)。RT是多种癌症的常见治疗方式，所有癌症患者中大约有70％的疾病治疗过程中接受了RT。放射线可以直接或间接作用造成机体的多器官损伤，其中，代谢旺盛、更新较快的生殖细胞最容易被射线损伤。既往研究表明，当卵巢暴露于辐射时射线通过以下几种作用损伤生殖细胞：1)卵母细胞会通过细胞死亡途径丢失；2)颗粒细胞损伤导致性腺激素产生受损；3)卵巢血管和间质受到损害。这些损伤导致POI，甚至卵巢早衰(premature ovarianfailure POF)，POF是POI的终末阶段。POI是女性40岁之前出现月经稀发、闭经，并有两次或两次以上基础卵泡刺激素(follicle stimulating hormone FSH)≥25U/L，雌激素水平下降。临床上主要表现为全身各个系统并发症，如骨质疏松、心血管疾病、老年性痴呆等，并伴随生殖器官的萎缩。严重危害女性的身心健康。另外，放射线不仅损伤卵巢，子宫暴露于放射线也会导致子宫内膜、子宫肌层和血管结构的不可逆转的损害，从而进一步导致POI/POF的发生。不同报道中癌症患者经过RT后POI的发生率，文献检索发现POI的患病率从2.1％到82.2％不等。POI的发生与治疗剂量、个体年龄、放疗范围和个体卵巢储备有关，并且除盆腔以外，腹部、头颅及全身均可以导致POI，但盆腔放疗对卵巢功能的损伤最为严重，而且既往研究证实卵巢功能障碍的发生率与放疗剂量显著相关。终末期的POI即POF是不可逆的，但是早期发现并及时有效治疗可能会延迟甚至改善病情。因此，寻找一种有效而安全的保护策略对于年轻的癌症患者和医师都是至关重要的。

RT所致POI发生机制：研究发现，放射线导致组织中水分子裂解直接产生活性氧自由基,通过诱发吞噬细胞呼吸爆发等作用间接产生活性氧自由基，使组织细胞的氧化还原平衡破坏，产生氧化胁迫，直接损伤蛋白质、核酸、脂质等生物大分子，或扰乱细胞的信号传导途径，对组织细胞造成可逆或不可逆的损伤。实际上吞噬细胞行使功能的物质基础就是活性氧产物,它们不仅能对组织细胞直接作用导致机体炎症发生,还能通过局部生成的趋化因子放大炎症反应。氧自由基的产生导致毛细血管膜的通透性增强，照射后最突出的病理变化就是早期岀现渗出性水肿，其渗出液含有溶解的低纤维蛋白，它的长期存在并持续刺激成纤维细胞增生并分泌胶原蛋白，可导致纤维化形成。因此，清除活性氧自由基是降低辐射反应的有效方法之一。卵巢对辐射高度敏感，损伤机制通过电离和活性氧类的形成导致卵泡细胞凋亡、氧化应激、卵巢萎缩、皮质纤维化和血管损伤。这些变化导致炎性细胞的积累和一系列炎性因子的释放。这些炎性因子促进大量氧自由基、活性氧(ROS)产生和细胞毒性发生。这可以归因于微环境中炎性和纤维化介质的增多、表观遗传变化和正常氧代谢的破坏，导致卵泡DNA直接损伤、卵泡萎缩和卵巢储备降低，最终引起卵巢激素的产生减少而过早出现更年期。申请人在前期研究中发现，放射性损伤导致卵巢炎性因子产生增加，ROS积累，大鼠性周期及性激素紊乱，卵泡闭锁，卵巢功能受损伤。结合研究背景和前期研究基础，申请者提出科学问题：通过拮抗放疗所致的氧化和炎性损伤，清除体内的氧自由基，是否能有效地抵抗放射线对卵巢的损害、防止POI的发生？