[发明专利]贴壁密度梯度法联合EGF培养人脐带间充质干细胞的方法

摘要

本发明提供一种贴壁密度梯度法联合EGF培养人脐带间充质干细胞的方法，包括如下步骤：UC-MSCs的分离，UC-MSCs的原代培养，UC-MSCs的传代培养与扩增，UC-MSCs的冻存和复苏，以及UC-MSCs细胞免疫表型的检测。本发明采用贴壁密度梯度法，加入4ng/ml表皮生长因子(EGF)，将贴壁培养和消化时间控制相结合，获得纯度和活性较高人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)，所述的贴壁密度梯度法联合EGF具有操作简单，快速实用等优点，是一种较为有效的分离纯化UC-MSCs的方法。

主权项

一种贴壁密度梯度法联合EGF培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：UC‑MSCs的分离，UC‑MSCs的原代培养，UC‑MSCs的传代培养与扩增，UC‑MSCs的冻存和复苏，以及UC‑MSCs细胞免疫表型的检测；其中，所述UC‑MSCs的分离步骤包括：无菌条件下，将胎儿脐带浸入PBS中，4℃保存；在超净台内从培养基中取出脐带，用含有双抗和两性霉素的D‑Hanks液充分冲洗脐带冲去残存积血；撕掉脐带表面的羊膜得到间充质组织，用组织剪将脐带组织剪碎成1mm3大小的组织块，将组织块移至内含一磁力搅拌子的玻璃瓶中，加入胶原酶，37℃下持续磁力搅拌下消化30分钟；向胶原酶‑组织块消化体系内加入终浓度为0.125％的胰酶，在37℃环境中继续磁力搅拌消化30分钟后，加入10％体积的胎牛血清终止消化；消化产物先后经100目及200目的细胞筛过滤，去除未消化的组织，收集滤液；所述UC‑MSCs的原代培养步骤包括：将脐带细胞悬液移入离心管，配平，2000rpm离心15分钟，弃上清，收集细胞；将收集的细胞用PBS吹打成均匀悬液，1500rpm旋转15分钟洗涤，收集细胞；接种细胞前吸取FBS加入细胞培养瓶，置37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱孵育30分钟，对培养瓶进行包被；弃包被液，用含20％FBS，4ng/mlEGF的DMEM/F12完全培养液重悬消化分离所得细胞，吹打均匀，计数细胞；调整细胞浓度为1.0×106细胞/ml，接种于包被后的细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，相差显微镜动态观察；培养4‑5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3‑4天半量换液一次；观察细胞贴壁生长至80‑90％汇合时，以0.25％胰蛋白酶‑0.01％EDTA消化，所得细胞为原代细胞；所述UC‑MSCs的传代培养与扩增步骤包括：观察原代培养细胞贴壁生长至80‑90％汇合时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取PBS缓冲液加入培养瓶内洗涤，弃去洗液；加入胰蛋白酶‑EDTA消化液浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察；加入FBS中止胰酶消化；加入PBS反复吹打冲洗，在室温下900rpm离心10分钟；弃去上清液，加入DMEM/F12 重悬细胞，按1∶2‑1∶3比例传代培养；置37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，计为第1代UC‑MSC；待细胞生长至80‑90％汇合时，重复上述操作进行多代细胞培养扩增；以及所述UC‑MSCs细胞免疫表型的检测步骤包括：取培养第2或第3代细胞，首先用0.25％的胰蛋白酶消化后，然后用含1％小牛血清白蛋白的PBS调整细胞浓度至1×107/ml；分别加入鼠抗人单克隆抗体，置4℃孵育半小时，PBS洗1次，进行流式细胞仪检测分析。