[发明专利]一种ASP联合hAD-MSCs治疗POI的实验方法

权利要求书

1.一种ASP联合hAD-MSCs治疗POI的实验方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)ASP含药血清的制备：当归多糖含药当归用量按照临床用量换算成大鼠的用量，当归多糖按当归的用量同比换算成相对剂量；当归多糖组按254.2mg/kg/d腹腔注射1周，注射完后2小时处死大鼠，心脏取血，常规方法收集血清，56℃30min，灭活补体，0.22μm滤过除菌，-20℃保存备用；

2)不同浓度ASP含药血清加入培养基中培养hAD-MSCs，探索最佳浓度ASP含药物血清浓度，并对hAD-MSCs进行鉴定、纯化；

3)hAD-MSCs移植：采用尾静脉和卵巢局部两种移植路径，hAD-MSCs移植方式分为一次移植，放疗后4周移植一次、两次移植放疗开始和放疗后4周各移植一次；植入PKH26标记hAD-MSCs4×10⁶/0.6mlPBS；

4)实验分组：

a.对照组：腹腔注射与ASP组等时等量的生理盐水；

b.假手术组：同hAD-MSCs卵巢移植组，麻醉下手术切开腹部，暴露卵巢，向卵巢注射等量PBS；

c.戊酸雌二醇组：给予0.3mg/kg/d腹腔注射，稀释药物生理盐水同ASP组；

d.模型组：构建放疗模型，方法同前；

e.ASP:放疗开始腹腔注射ASP254.2mg/kg/d，共4周；

f.hAD-MSCs组：移植PKH26标记含ASP药物血清培养hAD-MSCs4×10⁶/0.6mlPBS，经尾静脉和卵巢两种途径移植，分一次移植组和两次移植组；

g.hAD-MSCs+ASP组：腹腔注射ASP联合PKH26标记ASP含药血清培养hAD-MSCs移植，腹腔注射ASP同e组，hAD-MSCs移植同f组；

h.hAD-MSCs对照组+ASP组：腹腔注射ASP联合移植PKH26标记无ASP含药血清培养hAD-MSCs，移植方法和ASP使用同g组；

i.hAD-MSCs+ASP组+LY294002阻断剂，阻断hAD-MSCs联合ASP上调PI3K/AKT/FOXO3a磷酸化信号通路的表达，对其作用机制进行验证；

5)一般情况：每天8:00-9:00AM进行阴道脱落细胞涂片检查，对大鼠动情周期进行观察；选择消毒棉签插入大鼠阴道约0.5cm处，并轻轻转动1圈，取出后在洁净载玻片上均匀涂抹，晾干，巴氏染色，每2周统计正常性周期大鼠的比例；每天观察大鼠的饮食，毛发，活动及二便等情况，并记录体重；

6)卵巢和子宫系数：hAD-MSCs移植后适应性喂养一周脱颈椎法处死大鼠，取出卵巢、子宫，新鲜称重，计算卵巢和子宫重量指数；同时将心、肝、肺、骨髓、卵巢和子宫等器官制备冷冻和石蜡组织切片，显微镜下计数卵巢上各级卵泡和黄体数，测量子宫肌层和子宫内膜的厚度；

7)卵巢功能：放疗当天，放疗后每两周经尾静脉取血测量大鼠雌二醇E2、促黄体生成素LH、FSH、抗苗勒管激素AMH、孕激素P、雄激素T；

8)激光共聚焦和活体成像了解干细胞在各器官分布情况；

9)电镜观察各级卵泡和子宫内膜超微结构变化；

10)免疫组化测定颗粒细胞表面标志Fshr和卵母细胞表面标志DDX4表达；

11)Elisa法测定卵巢和子宫组织抗氧化酶与氧化产物ROS、SOD、MDA、GSH-Px；炎性指标白介素-6、白介素-1β、肿瘤坏死因子-αTNF-α；血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子-2、胰岛素样生长因子-1、肝细胞生长因子HGF的分泌情况；

12)Western-blot测定卵巢组织FOXO3a、PI3K、AKT、Bim、FasL、Fas、P27^kip1、caspase-3/Cleaved-caspase-3、caspase-8/Cleaved-caspase-8总蛋白和磷酸化水平变化情况；

13)Tunel染色测定卵泡颗粒细胞和卵母细胞的凋亡情况；

14)免疫荧光双标记测定卵巢组织FOXO3a表达，鉴定FOXO3a的上下游目标的表达，对Bim、FasL、P27^kip1抗体的双重免疫荧光染色；

15)合笼实验：每组选取S-D大鼠4只，与经验证具有正常受精功能的雄鼠，按雌：雄比例2:1进行交配，观察幼鼠的数量，死亡率，畸形率，体重，了解对生殖结局的影响；进一步评价其疗效和安全性。