[发明专利]定量检测无细胞蛋白质合成系统目的蛋白产量及筛选高催化活性酶蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种定量检测无细胞蛋白质合成系统目的蛋白产量及筛选高催化活性酶蛋白的方法。该定量检测CFPS系统目的蛋白产量的方法使用分割荧光蛋白自发结合发出的荧光强度值，可快速地分析CFPS系统中目的蛋白的表达量，有利于CFPS系统中目的蛋白表达量的快速检测；同时，基于该方法，通过计算各个酶蛋白催化得到的产物量与分割荧光蛋白自发结合后的荧光强度值的比值，可快速筛选高催化活性的酶同系物，无需进行常规的大肠转化‑表达‑纯化流程，大大节省了时间与材料成本，提高了筛选速度，且避免了由于蛋白表达量过低而引起的高催化活性蛋白的漏筛风险，有利于实现高催化活性酶蛋白快速准确的筛选。

技术领域

本发明涉及分子生物学与合成生物学技术领域，特别涉及一种定量检测无细胞蛋白质合成系统目的蛋白产量及筛选高催化活性酶蛋白的方法。

背景技术

分割荧光蛋白是一种对荧光蛋白的改造技术：在特定位置将完整的荧光蛋白分割成两段或多段多肽，这些多肽链单独存在时都不会产生荧光，而当同时存在时则会自发组装形成完整的荧光蛋白并产生荧光。通过将分割的短链荧光蛋白多肽与靶标蛋白融合表达并检测其与另一段荧光蛋白多肽的组装情况，该技术已成功应用于体内或体外的蛋白可溶性表达分析、蛋白质在胞内的定位与运输监测、蛋白与蛋白相互作用检测等方面。

无细胞蛋白质合成(Cell-free protein synthesis，CFPS)系统利用细胞抽提物中的酶和辅助因子以及外源补充的底物和能量物质，以外源DNA或mRNA为模板实现目的蛋白的体外合成。与基于细胞的蛋白质表达平台相比，CFPS主要具有三个优势：1)无需维持细胞存活与生长，CFPS可以生产细胞体系难以生产或对细胞有潜在毒性的蛋白质；2)由于无需进行繁琐费时的克隆操作，该系统表达多种蛋白质具有更快的速度和更好的灵活性；3)该系统的开放性使得能够方便地对其进行更加直接、精细的调控。由于上述优势，CFPS已经逐渐被应用于抗体的高通量表达与筛选、蛋白质修饰的快速表征、生物合成途径的原型设计与代谢工程改造等领域。对CFPS系统表达的目的蛋白进行定量是应用CFPS的基础，但由于CFPS系统的细胞提取物中存在多种细胞内源的酶蛋白，故无法使用常用简便的蛋白质定量方法，如Bradford法对表达的目的蛋白进行定量检测。而目前常用的检测CFPS系统目的蛋白产量的方法为首先用放射性C元素标记表达的蛋白，之后再使用液滴闪缩计数与放射自显影实现蛋白定量，这种定量方法操作繁琐费时，需要娴熟的实验技巧与专业的设备条件。故目前仍缺少一种能够快速简便地实现对CFPS系统表达的蛋白进行定量的方法。

从不同物种来源的酶同系物中筛选具有高催化活性的酶蛋白是提高生物合成途径目的产物产量与生产效率的常用方法，但这一过程因通常需要进行多种蛋白的表达与纯化而往往费时费力。基于以上背景，建立一种快速简便的定量检测CFPS系统目的蛋白产量及快速筛选高催化活性酶蛋白的方法显得十分重要。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种定量检测无细胞蛋白质合成系统目的蛋白产量的方法。

本发明的另一目的在于提供所述定量检测无细胞蛋白质合成系统目的蛋白产量的方法的应用。

本发明的又一目的在于提供一种快速筛选高催化活性酶蛋白的方法。

本发明的再一目的在于提供所述快速筛选高催化活性酶蛋白的方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种定量检测无细胞蛋白质合成(CFPS)系统目的蛋白产量的方法，包括如下步骤：

(1)构建表达融合蛋白的质粒

将目的蛋白(酶蛋白)的基因序列和分割荧光蛋白短链多肽通过linker序列连接，得到目的蛋白-分割荧光蛋白短链多肽的DNA序列，然后将DNA序列插入到质粒载体上，得到表达融合蛋白的质粒；

(2)制备融合蛋白溶液