[发明专利]靶向人Claudin18.2和NKG2DL的嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明属于嵌合抗原受体细胞领域，一种靶向人Claudin18.2和NKG2DL的嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用,该嵌合抗原受体细胞含有靶向结合人Claudin18.2和靶向结合人NKG2DL的氨基酸序列。本发明的靶向Claudin18.2和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞能增强与肿瘤细胞的结合，明显提高抗肿瘤活性。

技术领域

本发明属于嵌合抗原受体细胞领域，涉及一种双特异性靶向人Claudin18.2(CLDN18.2)和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体的氨基酸编码序列、及其修饰的免疫应答细胞，以及它们的制备方法和在药物制备中的应用。

背景技术

随着生物技术的飞速发展，免疫细胞治疗已成为癌症治疗领域的第四大疗法。

癌症免疫疗法主要包括过继性细胞治疗、免疫调节剂、肿瘤疫苗以及免疫结合点阻断治疗等。其中，在细胞治疗领域，CAR-T疗法无疑已成为研究机构和制药公司争相“追捧”的明星。

CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell，嵌合抗原受体修饰的T细胞)为代表的免疫疗法，其原理主要是通过基因工程手段对病人自身提取的T细胞进行嵌合抗原受体的修饰形成CAR-T细胞，该T细胞能特异性地识别肿瘤表面相关抗原(肿瘤细胞标志物)，从而靶向杀伤肿瘤。

近年研究表明，NKG2DL蛋白的表达是细胞处于“应激状态”的一个指标，其在健康组织中很少有表达或仅短暂地表达，而通常在不同来源的各种肿瘤细胞表面有较高水平的表达。NKG2DL蛋白的受体为NKG2D，研究显示，NKG2D-NKG2DL系统在机体的抗肿瘤免疫中发挥着重要作用，NKG2D通过识别肿瘤细胞表面产生的NKG2DL来传递活化信号并激活免疫系统，从而对肿瘤细胞发挥杀伤作用。除此之外，研究发现自身免疫性疾病患者的血清中含有可溶性NKG2DL，NKG2D-NKG2DL系统在治疗自身免疫性疾病、抗炎、抗衰老等方面起到一定作用(参见Legroux L等人，Frontiers in Immunology，(2019))。因此，NKG2DL的表达作为机体发生肿瘤时肿瘤细胞上的一个特异性的改变，为肿瘤的免疫治疗提供了一个更为精确的靶点，为相关新疗法和药物的开发提供了启示。

此外，有研究表明，紧密连接蛋白Claudin是一种四次跨膜蛋白，NH2端和COOH端位于胞内，具有两个胞外环，迄今为止一共发现了27个家族成员。Claudin18.2是Claudin家族中在上皮紧密连接处表达的四次跨膜蛋白，是细胞紧密连接的重要分子，其构成了细胞旁屏障，控制细胞间分子流动。Claudin18.2是一个高度特异性的细胞表面分子，在正常的组织中仅表达在分化的胃粘膜上皮细胞上，使得开发针对Claudin18.2的治疗性抗体具有更大的抗癌潜力、更低的毒性，有更大的最佳用药剂量空间。Claudin18.2蛋白在胃癌、胰腺癌、卵巢癌、胆管癌和肺腺癌等实体瘤中高表达(参见Sahin等人，Clinical CancerResearch(2008))。另外据专家披露，Claudin18.2高表达的肿瘤往往不表达PD-L1，对PD-L1靶向的免疫抑制药物不敏感，因此是一个临床需求高度未被满足的领域。Claudin18.2在正常组织中的独特表达谱，以及在多种肿瘤中的异常表达情况使其成为了非常有吸引力的抗癌治疗靶标。同时Claudin18.2作为细胞膜表面蛋白，暴露的胞外结构允许抗体的结合，这些特点表明Claudin18.2是一个理想的治疗性靶点。

综上所述，我们构建了基于CLDN18.2-NKG2DL系统的激活性靶标Claudin18.2和NKG2DL及其突变肽作为靶向肿瘤区域的双特异性嵌合抗原受体修饰的新型高特异性杀伤力的免疫应答细胞用于肿瘤的治疗。

发明内容