[发明专利]一种通过将荧光微球偶联抗体检测目的蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种通过将荧光微球偶联抗体检测目的蛋白的方法。本发明中，进行抗体标记与纯化；在1.5mL的微量离心管中加入50μL的量子点，然后加入1OμLEDC和10μLsulfo—NHS溶液，加磷酸盐缓冲液补至800μL，不停地混合溶液，室温下反应20min；加入纯化的抗体200μL，37℃振荡反应2h；加入100μL甘氨酸，封闭量子点上未反应的羧基；将偶联反应所得到的产物4℃，12000r/min离心20min，所得沉淀即为纯化的偶联有荧光微球的P1目的蛋白抗体，以量子点偶联产物荧光效率测定、偶联产物的免疫反应性测定和量子点偶联产物检测目的蛋白抗原的方式通过将荧光微球偶联抗体检测目的蛋白，从而达到了更加快速准确的检测方式，从而提高了检测速率，为人们的研究带来了更多的便利。

技术领域

本发明属于抗体检测技术领域，具体为一种通过将荧光微球偶联抗体检测目的蛋白的方法。

背景技术

如果蛋白有纯化标签并且是过表达的话就比较容易判断，一般纯化过程中通过SDS电泳不同组分确定目的蛋白。如果没有纯化标签，一般是通过SDS电泳或者双向电泳和蛋白活性实验(如果蛋白有生物活性，比如酶)，或者通过western blot来检测目的蛋白。

但是常见的检测方法其分离率低、时间长，成本高不适于临床应用。

发明内容

本发明的目的在于：为了解决上述提出的问题，提供一种通过将荧光微球偶联抗体检测目的蛋白的方法。

本发明采用的技术方案如下：一种通过将荧光微球偶联抗体检测目的蛋白的方法，所述通过将荧光微球偶联抗体检测目的蛋白的方法包括以下步骤：

S1:准备50mMpH6.0的活化buffer，醋酸或MESbuffer更合适；用活化buffer悬浮微球，使其浓度为1％w/v；

S2:每1ml微球悬液加入20mg的EDC，室温孵育20分钟，然后再次加入20mg/mL的EDC，继续室温孵育20分钟；

S3:离心或超滤，用等体积的包被缓冲液清洗两次微球，最后悬浮在包被缓冲液中；

S4:用包被缓冲液溶解抗体到1mg/mL，包被缓冲液pH7～9，浓度为50mM～100mM；

S5:将抗体快速加入的搅拌中的微球悬液中，持续搅拌，室温孵育2～5小时；

S6:每1ml反应溶液中加入2.5ul的乙醇胺，持续搅拌并室温孵育10分钟；

S7:离心或超滤，用储存缓冲液悬浮，重复两次，移除未结合的抗体和乙醇胺，得到荧光微球抗体；

S8:进行目的蛋白多抗的制备，先进行P1重组蛋白的提取与纯化，纯化的重组蛋白加等体积弗氏完全佐剂免疫偶联抗体，多点皮下注射免疫，以弗氏不完全佐剂加强免疫3次后颈动脉采血获得检测用的偶联抗体，以ELISA法测定抗体效价；

S9:进行IgG的提取纯化，对采集的免疫血清用硫酸铰沉淀法粗提免疫球蛋白，取免疫血清加入饱和(NH₄)₂SO₄使其成20％溶液，以除去纤维蛋白；吸取离心上清加入饱和(NH₄)₂SO₄溶液；使之成为50％溶液以除去白蛋白；

S10:之后进行抗体标记与纯化；在1.5mL的微量离心管中加入50μL的量子点，然后加入1OμLEDC和10μLsulfo—NHS溶液，加磷酸盐缓冲液补至800μL，不停地混合溶液，室温下反应20min；加入纯化的抗体200μL，37℃振荡反应2h；加入100μL甘氨酸，封闭量子点上未反应的羧基；将偶联反应所得到的产物4℃，12000r/min离心20min，所得沉淀即为纯化的偶联有荧光微球的P1目的蛋白抗体；