[发明专利]一种通过将荧光微球偶联抗体检测目的蛋白的方法

权利要求书

1.一种通过将荧光微球偶联抗体检测目的蛋白的方法，其特征在于：所述通过将荧光微球偶联抗体检测目的蛋白的方法包括以下步骤：

S1:准备50mMpH6.0的活化buffer，用活化buffer悬浮微球，使其浓度为1％w/v；

S2:每1ml微球悬液加入20mg的EDC，室温孵育20分钟，然后再次加入20mg/mL的EDC，继续室温孵育20分钟；

S3:离心或超滤，用等体积的包被缓冲液清洗两次微球，最后悬浮在包被缓冲液中；

S4:用包被缓冲液溶解抗体到1mg/mL，包被缓冲液pH7～9，浓度为50mM～100mM；

S5:将抗体快速加入的搅拌中的微球悬液中，持续搅拌，室温孵育2～5小时；

S6:每1ml反应溶液中加入2.5ul的乙醇胺，持续搅拌并室温孵育10分钟；

S7:离心或超滤，用储存缓冲液悬浮，重复两次，移除未结合的抗体和乙醇胺，得到荧光微球抗体；

S8:进行目的蛋白多抗的制备，先进行P1重组蛋白的提取与纯化，纯化的重组蛋白加等体积弗氏完全佐剂免疫偶联抗体，多点皮下注射免疫，以弗氏不完全佐剂加强免疫3次后颈动脉采血获得检测用的偶联抗体，以ELISA法测定抗体效价；

S9:进行IgG的提取纯化，对采集的免疫血清用硫酸铰沉淀法粗提免疫球蛋白，取免疫血清加入饱和(NH₄)₂SO₄使其成20％溶液，以除去纤维蛋白；吸取离心上清加入饱和(NH₄)₂SO₄溶液；使之成为50％溶液以除去白蛋白；

S10:之后进行抗体标记与纯化；在1.5mL的微量离心管中加入50μL的量子点，然后加入1OμLEDC和10μLsulfo—NHS溶液，加磷酸盐缓冲液补至800μL，室温下反应20min；加入纯化的抗体200μL，37℃振荡反应2h；加入100μL甘氨酸，封闭量子点上未反应的羧基；将偶联反应所得到的产物4℃，12000r/min离心20min，所得沉淀即为纯化的偶联有荧光微球的P1目的蛋白抗体；

S11:进行量子点偶联产物荧光效率测定：用荧光分光光度计测定量子点标记的抗体，通过标记物荧光强度的测定，判定抗体一量子点的偶联反应是否改变量子点的荧光效率；

S12:进行偶联产物的免疫反应性测定，取目的蛋白全菌抗原2μL；滴于硝酸纤维素膜上，4℃干燥后用BSA—PBS4℃封闭过夜；用PBS洗膜3次，干燥后，在含有包被目的蛋白抗原处分别加入量子点偶联-P1重组蛋白抗体、量子点、P1重组蛋白抗体和PBS反应；37℃作用2h，反应后用PBs洗3次，在紫外灯下观察结果；

S13使用量子点偶联产物检测目的蛋白抗原，取对数生长期培养物，以12000r/min的速度离心30min，弃上清，沉淀加入0.01mol/L的PBS溶液，充分混匀，离心洗涤3次，收集沉淀反复冻融3次后，即为目的蛋白菌体抗原，加入0.01mol/L的PBS制备菌悬液，取5μL菌悬液滴加于玻片上，室温自然干燥，用-20℃预冷的丙酮固定；将1：40稀释的偶联有P1重组蛋白多克隆抗体的量子点滴加入上述抗原片上，于37℃湿盒中作用45min，用PBS洗涤3次，自然干燥，滴加碱性缓冲甘油，加盖玻片封片，在荧光显微镜下观察；

S14:分别将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、甲型链球菌和肺炎链球菌抗原按步骤S11、S12、S13的操作，以PBS作为空白对照进行检测，最后进行试验结果的分析，从而结束整个实验过程。

2.如权利要求1所述的一种通过将荧光微球偶联抗体检测目的蛋白的方法，其特征在于：所述步骤S3中，移除未结合的化合物或蛋白，如果颗粒直径大于0.2um，可以通过离心的方法，微球可以重新悬浮，然后搅拌，接着温和的超声分散。

3.如权利要求1所述的一种通过将荧光微球偶联抗体检测目的蛋白的方法，其特征在于：所述步骤S4中，reaction buffer的组成根据蛋白种类的不同而改变，常用buffer有醋酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、MES缓冲液。