[发明专利]一种适用于Pacbio三代长读长测序的高质量浒苔DNA的提取方法

说明书

本发明公开了一种适用于Pacbio长读长测序的浒苔DNA的抽提纯化方法。本发明使用CTAB抽提浒苔基因组DNA结合磁珠纯化，所提取的DNA纯度高，OD260/280达到1.8‑2.1，OD260/230达到2.0‑2.3，所得DNAQubit/Nanodrop比值在0.5‑2。本发明所提取的DNA片段长度大于50kb，总量达到微克级别，能满足Pacbio三代长读长测序的要求。

技术领域

本发明属于DNA提取领域，涉及一种适用于Pacbio三代长读长测序的高质量浒苔DNA的提取方法。

背景技术

浒苔中富含碳水化合物、蛋白质、粗纤维、氨基酸、脂肪酸、维生素和多种矿物质，碳水化合物主要就是多糖，浒苔多糖是浒苔的主要活性成分之一，据报道，浒苔多糖具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、降血脂等多种生物学活性。但是这种成分大量存在于植株中，在DNA抽提时会造成提取溶液粘稠，DNA与多糖成分难以分开，所抽提的DNA纯度较差，多糖等成分含量偏高，给后续的Pacbio三代测序带来较大困难。

PacBio三代测序是指单分子测序技术，在建库测序过程中不需要涉及PCR扩增，对每一条DNA分子的单独测序。具有超长读长，不需要模板扩增、运行时间较短等特点。原始DNA长度直接决定最后测序获得的subreads的读长。它对DNA的OD260/280要求1.8-2.1，对260/230要求2.0-2.2，对Qubit和Nanodrop比值要求0.5-2，要求DNA主带单一无拖尾，无RNA污染，无蛋白质污染，无螯合剂污染，无不溶物质等，否则对测序结果都会造成影响，甚至零产出无数据。

青岛华大基因研究院发过一篇植物基因组DNA提取方法和测序方法及应用的专利(CN111909926A)，本方法采用CTAB法抽提植物基因组DNA，再用醋酸钾和无水乙醇孵育上清去除蛋白质和多糖，结合阴离子交换树脂纯化DNA溶液，从而获得所述植物的基因组。其中阴离子交换树脂使用的是QIAGEN Genomic-tip，首先这种柱子成本较高；其次，大量的测试结果显示该方法用于抽提试剂盒指定样本效果能达到说明书的水平，但是用于浒苔样本DNA的抽提则很难达到预期效果，会发生如CN111909926A图3所显示的琼脂糖电泳时在胶孔中会有蛋白污染，DNA的纯度不达标，而且DNA的得率也偏低的情况。

另外，目前市面上也有很多商业化的DNA抽提试剂盒，即使选用业内较知名的天根植物DNA抽提试剂盒进行测试，但是抽提结果也达不到Pacbio三代测序的要求。

对浒苔样本提取DNA的天根植物试剂盒方案：

操作步骤：

1.取植物新鲜组织约100mg或干重组织约30mg，加入液氮充分碾磨。

2.将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μl 65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。

3.加入700μl氯仿，充分混匀，12,000rpm(～13,400×g)离心5min。注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚︰氯仿/1︰1进行等体积抽提。

4.小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μl缓冲液GP2，充分混匀。

5.将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，弃掉废液。

6.向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7.向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8.重复操作步骤7。