[发明专利]全羊源单克隆抗体的高通量制备方法

说明书

本发明涉及动物免疫，基因工程，抗体工程及自动化设备技术领域，尤其涉及高通量全羊源单克隆抗体的制备方法。提供的方案包括免疫、分选、扩增、重组、表达几个步骤，完全摒弃了利用传统杂交瘤技术，B细胞培养技术和噬菌体展示技术来获取羊单克隆抗体，无需进行细胞培养，通过直接克隆抗体VHVL，并构建至表达载体上实现羊单克隆抗体发现的技术，将羊单克隆抗体开发时间从8‑12周才能确定的完成整抗体序列，缩短至3周时间。并完全解决了杂交瘤技术，B细胞培养技术和噬菌体展示技术过程中，细胞凋亡，不稳定性和随机配对等问题。实现了世界上第一个天然配对的羊单个B细胞抗体发现技术。

技术领域

本发明涉及动物免疫，基因工程，抗体工程及自动化设备技术领域，尤其涉及全羊源单克隆抗体的高通量制备方法。

背景技术

绵羊和山羊是目前最广泛用于产生多克隆抗体的宿主物种，属于山羊亚科，这两个物种有很多共同之处。一个共同的特点是它们都拥有大量的抗血清，通常每个羊的血清产量约为200-300毫升，很多公司优先选择绵羊和山羊作为大规模生产多克隆抗体物种。研究人员能够从一只羊中获得大量抗体，从而消除个体和批次之间的差异。除此之外，羊表现出更高的免疫敏感性，比其他宿主物种的候选者能够识别更广泛的表位。免疫羊的抗体通常比标准小鼠，大鼠和兔抗体具有更高的特异性和亲和力，这表明在生物医学、兽医和农业方面具有巨大的潜力。

羊单克隆抗体是新一代单克隆抗体应用于科研、诊断和治疗。羊单克隆抗体主要以Lambda型抗体为主，在IgG抗体中占比约90％。与来自其他动物宿主的单克隆抗体相比，羊单克隆抗体的主要优势包括但不限于：超高亲和力–与目标的结合时间更长。这种亲和力通常比啮齿动物抗体大10至100倍；更广泛的表位识别-能够识别其他抗体技术失败的“困难”目标；更高的灵敏度–能够在目标物浓度非常低(例如激素)的情况下快速结合目标物；更高的特异性–能够精确区分密切相关的分子，例如药物衍生物；消除了交叉反应。羊单克隆抗体目前被用于各种生物医学应用。例如，具有高特异性和亲和力的单克隆绵羊抗体已被证明是适用于诊断、预防和治疗多种危及生命的细菌感染的理想临床先导物。

目前羊单克隆抗体发现的主要技术方案包括：羊杂交瘤技术，噬菌体展示技术。国外的两家公司Creative Diagnostics和Bioventix同时拥有独特的羊B细胞融合技术，即羊杂交瘤技术，尤其Bioventix公司通过该技术拿到了很多针对激素和毒品等小分子的高亲和力和高特异性的羊单克隆抗体，在诊断领域被广泛应用。但由于筛选羊融合细胞比较困难，使其没有在市场中得到广泛的应用。很多公司都在运用效率比较低的噬菌体展示技术来获得羊单克隆抗体。噬菌体展示技术获得的抗体效率低，且是随机配对的，未经过免疫监视/耐受选择的羊重组抗体，不是真正意义上的全羊源抗体，往往亲和力差。

为了实现高通量、高品质的制备真正意义的全羊源单克隆抗体，打破外国技术垄断，在全兔源单克隆抗体技术(专利号：202110545707.0)的基础上我们发明了世界上第一个羊单个B细胞抗体发现技术。这项研究成果的发现，标志着在生物科技领域方面，我们又有了新的突破和发展，在世界上也处于领先地位。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供提供高通量、高品质的全羊源单克隆抗体的制备方法。

本发明提供的高通量全羊源单克隆抗体的制备方法，包括：

步骤1：抗原免疫羊后取外周血分离单个核细胞；

步骤2：流式细胞术分选抗原特异性B淋巴细胞；

步骤3：扩增所述抗原特异性B淋巴细胞的可变区和恒定区；

步骤4：所述可变区和恒定区经重组、表达获得羊源单克隆抗体。

本发明所述制备方法的步骤1中：所述免疫的抗原为蛋白、多肽、小分子化合物或核酸。本发明实施例中，所述抗原为PCT(降钙素原，procalcitonin)。