[发明专利]全羊源单克隆抗体的高通量制备方法

权利要求书

1.高通量全羊源单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1：抗原免疫羊后取外周血分离单个核细胞；

步骤2：流式细胞术分选抗原特异性B淋巴细胞；

步骤3：扩增所述抗原特异性B淋巴细胞的可变区；

步骤4：所述可变区经重组、表达获得羊源单克隆抗体；

所述流式细胞术分选的标志物选自如下I～IV中任一种组合：

I)、7AAD、CD4、CD8、CD14、IgM、CD21、抗原；

II)、7AAD、CD4、CD8、CD14、CD45R、IgM、CD21、抗原；

III)、7AAD、CD4、CD8、CD14、IgM、IgG、抗原；

IV)、7AAD、CD4、CD8、CD14、CD45R、IgM、IgG、抗原。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中：

所述免疫的抗原为蛋白、多肽、小分子化合物或核酸；

所述羊为雌性绵羊；

所述免疫为间隔两周免疫，免疫6～9次。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，以标志物组合I)，分选外周血淋巴细胞中的抗原特异性B淋巴细胞。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述扩增包括反转录、第一轮巢式PCR扩增和第二轮巢式PCR扩增；

所述第一轮巢式PCR的正向引物在IgG先导肽区域，反向引物位于IgG CH1区域；

所述第二轮巢式PCR获得重链可变区扩增产物、轻链L可变区扩增产物和轻链κ可变区扩增产物。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一轮巢式PCR扩增的引物包括：

1st-sVH-F ATGAACCCACTGTGGACCCTC

1st-sVH-R1(IgG)CAAGAAGTCAGAGGGTAGAC

1st-sVH-R2(IgE)CAGGTCCTCAAGGGGTAGATG

1st-sVH-R3(IgA)CCAAGGCTCAGTGGGAAGATG

1st-sVH-R4(IgM)CGGGGAGCTCACACAGGACAC

1st-sVK-F1 CTBGGKCTCCTSCTGCTCTGG

1st-sVK-F2 ATGGTGTTTCCATCDCAGCT

1st-sVK-F3 TATTAAAAATTTCCTGTGGG

1st-sVK-F4 CTTAGGTTTAKCTACATCCT

1st-sVK-F5 ATTACTTTTGTTTCCCCCTGGG

1st-sVK-F6 CCCAGAGCTCAGCCCACTG

1st-sVK-R TGGTTTGAAGAGGAAGACG

1st-sVλ-F1 CTCTGCACAGGRTCCYGGG

1st-sVλ-F2 ATGGCCTGGTCCCCTCTGCTC

1st-sVλ-F3 CCTCATCAGCMTCCTCACTC

1st-sVλ-F4 ATGGCCTGGACYCCTCTCC

1st-sVλ-F5 CTGCACAGGKTCCCTCTYC

1st-sVλ-R GTGACYGAGGGTGCGGACTTG。