[发明专利]一种用于判断斜带石斑鱼内脏白点病致病菌基因改造作用的联合型代谢标志物及检测试剂盒

说明书

本发明一种用于判断斜带石斑鱼内脏白点病致病菌基因改造作用的联合型代谢标志物及检测试剂盒，涉及石斑鱼脾脏样品中脂类代谢物磷脂酰乙醇胺（18:2）、羟基化脂肪酸（38:2）和磷脂酰肌醇（39:4）作为联合标志物，用于判别导致石斑鱼内脏白点病的变形假单胞菌中毒力基因clpV沉默对石斑鱼的作用。本发明还涉及该基因改造作用判别的试剂盒。通过检测经变形假单胞菌感染的石斑鱼脾脏样品中脂类代谢物的相对浓度，基于二元逻辑回归方程计算联合标志物变量P，以及确定的截点值，判断所述石斑鱼内脏白点病病原菌经基因改造后情况。所述试剂盒可实现高灵敏、检测高效且成本低，重复性好的特点，具有较好的应用前景。

技术领域

本发明涉及分析化学、生物化学以及水产学领域，具体涉及一种用于判断斜带石斑鱼内脏白点病致病菌基因改造作用的联合型代谢标志物及检测试剂盒。

背景技术

变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)，又称杀香鱼假单胞菌，是一种分布广泛的需氧型革兰氏阴性杆菌。该菌能引起大黄鱼(Larimichthyscrocea)、斜带石斑鱼(Epihepheluscoioides)等经济海水鱼类的内脏白点病，导致养殖鱼类在短期内大量死亡，造成严重的经济损失。宿主与病原菌之间的相互作用复杂，感染过程中涉及基因表达、代谢干扰等大量动态变化。这些相互作用对于理解宿主的抗感染能力以及病原体的致病机理至关重要。目前变形假单胞菌致鱼类内脏白点病的机制研究尚处于起步阶段。

前期工作中，基于高质量测序技术进行基因差异分析以及共表达网络分析，进一步结合RNA干扰技术，解析变形假单胞菌中clpV基因对毒力的影响，已明确clpV基因为致石斑鱼内脏白点病的关键毒力基因。经数字PCR技术检测病原菌在鱼体内各器官和组织的分布情况，发现脾脏中变形假单胞菌的载量均比其他组织高，且与感染时间呈正相关，结合病理组织切片可确定脾脏为变形假单胞菌感染斜带石斑鱼的重要靶器官。

对变形假单胞菌进行毒力基因改造是预防鱼类内脏白点病的有效手段之一。我们构建并采集了阴性对照组(PBS组)、野生型菌株感染组(WT组)与clpV基因沉默菌株感染组(clpV-RNAi组)的石斑鱼脾脏样品。结果表明，感染96hpi后，WT组石斑鱼脾脏具有大量白色斑点，大部分石斑鱼个体均已死亡，随后的病理学检验证实了其脾脏的特征性病理变化；PBS组与clpV-RNAi组的石斑鱼脾脏在病理学检验中均未见明显改变，且无死亡个例。以上表型发现与病理结果证实了病原菌毒力基因clpV的沉默对于石斑鱼内脏白点病的有效改善效果。由于致病机制的复杂性，对基因改造效果的判断方法较为有限，考虑到病理学检验的繁琐费时，因此，开发一种准确、稳定的方法用于判断斜带石斑鱼内脏白点病致病菌的基因改造效果，具有重要意义。

脂质组学为代谢组学研究范畴中的重要分支。脂质组学研究可借助色谱-质谱联用等技术，对细胞、组织和体液中的脂质代谢物开展高通量的定性定量分析。作为细胞膜的重要组成部分，脂质参与调节生命活动的很多重要过程，例如细胞的能量储存、物质运输、信号传导，细胞的发育、分化以及细胞凋亡等。近年来，脂类标志物在癌症、糖尿病、多囊卵巢综合征等重要疾病的临床诊断和研究中已有许多成功的案例。鉴于脂质代谢物在生物体中的关键调控作用，本发明采用基于超高效液相色谱-质谱联用的脂质组学技术和研究方法，检测宿主石斑鱼脾脏中的脂类代谢物，经过生物信息学分析，筛选目标脂质，旨在对病原菌关键毒力基因clpV改造后对宿主的作用效果进行判别。

本发明从鱼体脾脏脂质代谢谱比较中，经多次优选，确定了代谢标志物磷脂酰乙醇胺(18:2)、羟基化脂肪酸(38:2)和磷脂酰肌醇(39:4)的联合使用，提出了其用于对变形假单胞菌关键毒力基因clpV改造后对宿主作用效果进行判别的新用途。由于单一代谢物所受影响因素较多，脂类物质在生命体有着多重“身份”，因此从斜带石斑鱼模型中筛选出由少数代谢物构成的联合型的代谢标志物，并以判别公式计算“判别可能性”P值(Probability)，有助于改善判别灵敏度以及特异性。目前尚无将该三种脂质代谢物联合，用于判别石斑鱼内脏白点病致病菌基因clpV干预效果的报道。

发明内容