[发明专利]一种用于判断斜带石斑鱼内脏白点病致病菌基因改造作用的联合型代谢标志物及检测试剂盒

权利要求书

1.联合型标志物在用于判断斜带石斑鱼内脏白点病致病基因改造效果上的应用，所述致病基因为变形假单细胞菌中的毒力基因clpV，所述联合标志物包括：磷脂酰乙醇胺（18:2）、羟基化脂肪酸（38:2）和磷脂酰肌醇（39:4）。

2.联合型标志物在鉴别变形假单胞菌clpV基因沉默菌株石斑鱼感染组与野生型菌株石斑鱼感染组中的应用，所述联合标志物包括：磷脂酰乙醇胺（18:2）、羟基化脂肪酸（38:2）和磷脂酰肌醇（39:4）。

3.一种判断斜带石斑鱼内脏白点病致病基因改造效果的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括联合标志物，所述联合标志物包括：磷脂酰乙醇胺（18:2）、羟基化脂肪酸（38:2）和磷脂酰肌醇（39:4）。

4.如权利要求3所述的一种判断斜带石斑鱼内脏白点病致病基因改造效果的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括：

用于预处理来自受试石斑鱼的脾脏样品的提取液：所述提取液为同时包含正离子及负离子分析模式下的两类内标物的甲醇溶液，其中正离子模式内标物为1.87ug/ml磷脂酰胆碱（19:0/19:0），所述负离子模式内标物为1.00ug/ml脂肪酸（C18:0-d3）；磷脂酰胆碱（19:0/19:0）用于校正溶血磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇，脂肪酸（C18:0-d3）用于校正羟基化脂肪酸；

洗脱液：动相A为含10mM乙酸铵的乙腈/水溶液（v/v=6:4），流动相B为含10mM乙酸铵的异丙醇/乙腈溶液（v/v=9:1）。

5.一种计算受试石斑鱼脾脏样品中联合型标志物变量的方法，其特征在于所述标志物包括：磷脂酰乙醇胺（18:2）、羟基化脂肪酸（38:2）和磷脂酰肌醇（39:4），所述方法包括以下步骤：

1）以含有内标物的提取液处理来自受试石斑鱼的脾脏样本，沉淀蛋白后，进一步提取脂类代谢物，随后进行冻干，样品复溶后进行超高效液相色谱-质谱分析；

2）在超高效液相色谱-质谱分析获得的色谱图上，提取磷脂酰乙醇胺（18:2）、羟基化脂肪酸（38:2）和磷脂酰肌醇（39:4）的色谱峰强度；

3）以试剂盒中三种物质磷脂酰乙醇胺（18:2）、羟基化脂肪酸（38:2）和磷脂酰肌醇（39:4）的标准品对检测到的离子进行定性确认：将三种物质标准品溶液进行超高效液相色谱-质谱分析，确定三种标准品离子的色谱保留时间、三种离子的实测质核比、以及二级质谱特征离子，与受试样本中实测的三种物质相比较；

4）对每一受试样本中经定性后的三种物质的色谱峰强度分别与提取液中的内标物比较，获得三种物质的相对浓度；

5）以上述三种代谢物的相对浓度值，基于二元逻辑回归方程计算联合型标志物变量P。

6.如权利要求5所述的一种计算受试石斑鱼脾脏样品中联合型标志物变量的方法，其特征在于步骤2）中磷脂酰乙醇胺（18:2）的提取参数为:正离子模式，质核比为478.29337±5ppm的离子；羟基化脂肪酸（38:2）的提取参数为: 负离子模式，质核比为589.51958 ±5ppm的离子；磷脂酰肌醇（39:4）提取参数为: 负离子模式，质核比为899.56496±5ppm的离子。