[发明专利]一种同时检测猪肺炎支原体和猪衣原体的巢氏PCR引物组及其应用

说明书

本发明提供了一种同时检测猪肺炎支原体和猪衣原体的巢氏PCR引物组及其应用，属于分子诊断技术领域。本发明提供的同时检测猪肺炎支原体和猪衣原体的巢氏PCR引物组包括两对外侧引物Mhp‑O‑F、Mhp‑O‑R和C.suis‑O‑F、C.suis‑O‑R和两对内侧引物Mhp‑I‑F、Mhp‑I‑R和C.suis‑I‑F、C.suis‑I‑R。本发明以Mhp M12916S rDNA基因序列和C.suis ompA基因保守序列作为检测猪肺炎支原体和猪衣原体的诊断靶标，设计了巢氏PCR的两对外侧引物和两对内侧引物，能够同时检测猪肺炎支原体和猪衣原体，两轮PCR提高了PCR的灵敏性、抗干扰性和特异性，克服了普通PCR检测灵敏度低，特异性差等问题，与现有的间接免疫荧光，血清学等检测方法相比成本较低，检测周期短。

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，尤其涉及一种同时检测猪肺炎支原体和猪衣原体的巢氏PCR引物组及其应用。

背景技术

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopniumoniae,Mhp)是引起猪支原体肺炎(Mycoplasmal Pneumonia ofSwine，MPS)的病原微生物。猪支原体肺炎广泛流行于全世界各个养猪区域，该疾病流行所引起的医药成本的增加、猪生产性能的下降，每年对养猪业都造成巨大损失。猪肺炎支原体除直接引起猪支原体肺炎造成损失外，还是猪呼吸道综合症(porcine respiratory disease complex，PRDC)的主要病原之一。

猪衣原体病(Swine Chlamydiosis,C.suis)是由鹦鹉热亲衣原体(旧称鹦鹉热衣原体)的某些菌株引起的一种慢性接触性传染病，又称流行性流产、猪衣原体性流产。临诊上可表现为妊娠母猪流产、死产和产弱仔，新生仔猪肺炎、肠炎、胸膜炎、心包炎、关节炎，种公猪睾丸炎等。常因菌株毒力，猪性别、年龄、生理状况和环境的变化而出现不同的征候群。世界各国于20世纪60年代首先确认猪衣原体病，随后许多国家相继报道了该病。中国在20世纪80年代初，从羊流产和猪繁殖障碍病料中分离出鹦鹉热亲衣原体，从而证实中国动物衣原体病的存在。

上述两种病原也是猪用疫苗常见的外源污染毒，接种被猪肺炎支原体或猪衣原体污染的疫苗后，对猪群的健康有急性的或者持续的危害，类似临床报道时有发生。这也反映出我国用于上述两种外源病毒的检测方法存在灵敏度不够高的局限性，所以提高上述两种病原的检测灵敏度，迫在眉睫。

近年来，国内外学者建立了病原的分离培养、吉姆萨染色、免疫荧光试验、血清学试验、普通PCR诊断、普通PCR检测等技术进行Mhp和C.suis的检测。病原的分离培养是包括支原体在内所有病原微生物诊断的金标准，但是在大多数情况下并不会作为确诊猪肺炎支原体和猪衣原体感染的实验室手段；主要因为支原体分离固有的困难与缓慢。在实验室中，多采用免疫荧光的方法检测病原，但此种方法存在敏感性不足的缺点。血清学诊断方法可以应用于检测群体是否感染有猪肺炎支原体和猪衣原体，然而对于个体此种方法并不适用，因为感染猪肺炎支原体和猪衣原体的个体在不同毒力毒株、个体健康状态、母源抗体水平等多因素影响下其抗体转阳的时间从几周到几个月不等。聚合酶链式反应(Polymerasechain reaction，PCR)作为现在常用的检测猪肺炎支原体和猪衣原体的实验室诊断方法之一具有快速的特点，但需要注意的是普通PCR检测肺炎支原体和猪衣原体容易有假阳性的出现同时会出现交叉感染。因此，本领域亟需提供一种特异性和灵敏度均较高的能够同时检测猪肺炎支原体和猪衣原体的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能够同时检测猪肺炎支原体和猪衣原体的巢氏PCR引物组及其应用，特异性和灵敏度均较高，本发明巢式PCR引物组和检测方法能够检测到的病原最低拷贝数为10⁰个。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：