[发明专利]一种用于牙槽骨缺损修复的组织工程化材料制备方法

说明书

本发明公开了一种用于牙槽骨缺损修复的组织工程化材料制备方法，属于口腔医学和生物医疗技术领域，包括根尖牙乳头干细胞（SCAPs）和富血小板纤维蛋白（PRF），其操作步骤如下：1）SCAPs的分离、培养；2）SCAPs的免疫荧光法鉴定；3）PRF的制备；4）SCAPs/PRF复合体的构建及植入；本发明提供的一种用于牙槽骨缺损修复的组织工程化材料制备方法，可减少手术创伤，避免免疫排斥反应，可提高移植后患者的适应性，从而为临床上牙槽骨缺损修复提供一种新的综合治疗策略。

技术领域

本发明涉及口腔医学和生物医疗技术领域，具体为一种用于牙槽骨缺损修复的组织工程化材料制备方法。

背景技术

牙槽骨缺损是临床上较为常见的疾病，常由炎症、创伤、肿瘤、先天畸形等因素所致，例如牙周炎导致的牙槽骨吸收缺损是牙周病发生、发展的病理基础，也是阻碍牙周病预后的主要瓶颈。而牙槽骨一旦发生破坏吸收、形成缺损后，很难自行修复重建，尤其是大面积的牙槽骨缺损尚缺少一种理想的修复方法。因此，牙槽骨的再生修复对牙周组织的恢复具有重要的临床意义。

目前临床上牙槽骨缺损修复的方法主要有自体骨移植、异体骨移植和人工合成材料，但是其都有一定的缺点：如①自体骨是指从患者自身获得的骨，如下颌骨外斜线、上颌结节等。但是由于取自体骨的时候会造成二次手术的创伤，手术时间长，移植后患者适应性差，受患者年龄及自身代谢的影响较大，供体相应部位存在发病率，及伦理道德问题等诸多原因，导致多数患者难以接受而放弃。②异体骨移植最常见问题是可能会有一定的免疫排斥反应，同时供体和受体移植过程中也可能存在疾病传播的问题；也因价格昂贵及异体来源问题，使部分患者仍然无法接受。③将人工种植材料移植到颌骨区，也会有受体对材料的适应性问题，可能会产生排斥和感染等问题，成骨及骨诱导性相对自体骨而言较差，且种植体修复需要大量的牙槽骨骨量。

发明内容

本发明的目的在于克服上述背景技术困难，提供了一种牙槽骨骨密度增加，骨形成区增大，破骨细胞数量减少，对牙槽骨缺损具有良好修复效果的一种用于牙槽骨缺损修复的组织工程化材料制备方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种用于牙槽骨缺损修复的组织工程化材料制备方法，包括根尖牙乳头干细胞（SCAPs）和富血小板纤维蛋白（PRF），其操作步骤如下：

1）SCAPs的分离、培养，在无菌条件下，取出生一周内的SD乳鼠牙槽骨部分，用无菌磷酸盐缓冲液PBS洗去血污，用镊子拔出第三磨牙牙根，无菌剪刀剪取牙齿根部的根尖牙乳头组织；用枪头将剪下的牙乳头组织转移到含有Ⅰ、Ⅱ型混合胶原酶的离心管中并剪碎；置于37 ℃细胞培养箱中消化30 min；轻轻吹打消化后的组织，吸取一滴酶液在显微镜下观察，直至肉眼可见细胞团块掉落；加入DMEM/HIGH完全培养基终止消化，所述DMEM/HIGH完全培养基是往10 %的FBS种加入100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素的双抗；然后按1200r/min的离心频率离心3 min；吸取上清后加入3 ml DMEM完全培养基重悬细胞，制成单细胞悬液，然后接种于6 cm细胞培养皿备用；

2）SCAPs的免疫荧光法鉴定，先将细胞铺板于96孔板，达80%融合后，更换为成骨诱导培养基，设立对照组和成骨诱导组，每3-4天换液1次；采用4%多聚甲醛固定孔板内各组细胞；其次先以PBS清洗3遍，每次5 min；在0.1% Triton X-100的条件下室温通透10 min；再以PBS清洗3遍，每次5 min；5 %FBS封闭，37℃，1h；加入根据抗体说明书进行稀释的一抗，在4℃条件下孵育过夜；然后以PBS清洗3遍，每次5 min；CY3标记的二抗，在37℃条件下孵育1h；最后以PBS漂洗3次，5min/次，室温避光条件下孵育Hoechst 10min，最后荧光显微镜下观察拍照，检测CD24呈阳性即为根尖牙乳头干细胞；

3）PRF的制备，采用动脉抽血液10ml，置于无菌采血管中；立即将试管进行离心15min，离心频率为3000r/min；静置后，管内出现3层，由底层到上层分别为红细胞层、白色凝胶状PRF层、血清层，用无菌镊子夹取中间的PRF层备用；